De rol van matrix-metalloproteïnasen in chronische inflammatoire darmziekten: nieuwe inzichten en toepassingen.

Inflammatoire darmziekten (IBD), inclusief de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC), zijn chronische en invaliderende ziekten van het maagdarmstelsel. De incidentie en prevalentie van IBD stijgen wereldwijd, ook in ontwikkelingslanden. Vooral jonge mensen worden getroffen en dit leidt tot belangrijke morbiditeit en gedaalde levenskwaliteit. Ondanks uitvoerig onderzoek zijn de mechanismen van ontstaan, werking en aanhouden van inflammatie bij IBD nog steeds niet gekend. Er wordt aangenomen dat er een abnormale mucosale immuunrespons optreedt tegen de luminale microbiota en dit in genetisch voorbeschikte personen. In een toenemend aantal studies wordt gewezen op het feit dat matrixmetalloproteïnasen (MMPs) een belangrijke rol spelen in de pathogenese van IBD. MMPs worden gesecreteerd als latente pro-enzymen en vereisen proteolytische klieving voor activatie. De functie van MMPs bestaat uit enzymatische klieving van substraten in de extracellulaire matrix (ECM) alsook niet-ECM substraten (bijvoorbeeld cytokinen, chemokinen en barrière-eiwitten). De activiteit van MMPs wordt geregeld door “tissue inhibitors of metalloproteinases” (TIMPs). Een onevenwicht tussen MMPs en TIMPs kan leiden tot chronische inflammatie en verstoorde (her)opbouw van de ECM. Als gevolg van dit onevenwicht ontwikkelt een aanzienlijk aantal patiënten complicaties zoals ulcera en fistels door een verhoogde afbraak van de ECM, alsook stenose of fibrose door een verhoogde afzetting van collageen.

Het ziekteverloop van IBD is zeer heterogeen, patiëntafhankelijk en moeilijk te voorspellen door intermittente fasen van actieve ziekte en spontane of rustige perioden, tot stand gebracht door geneesmiddelen. Gastro-enterologen maken gebruik van een combinatie van klinische, endoscopische en histologische evaluaties om het ziekteverloop van een patiënt op te volgen. Frequent endoscopisch onderzoek is echter duur en onaangenaam voor de patiënt. Daarom is er nood aan niet-invasieve biomerkers die de artsen kunnen bijstaan in differentiële diagnose, vaststellen van ziekte-activiteit of respons op therapeutische behandeling. Verscheidene merkers in bloed en feces werden reeds onderzocht. Van deze worden C-reactief proteïne (CRP) en fecaal calprotectine momenteel in de kliniek gebruikt. Er bestaat echter niet één enkele biomerker waarvoor voldoende specificiteit en sensitiviteit is aangetoond om op dit moment invasief endoscopisch onderzoek te kunnen vervangen. De auteurs van verscheidene studies suggereren MMP-9 als nieuwe biomerker om ziekte-activiteit en respons op behandeling vast te stellen of te voorspellen in IBD. Metingen van MMP-9 in serum in combinatie met fecaal calprotectine werden onlangs geassocieerd met beeldvorming/endoscopisch-gedefinieerde inflammatie in patiënten met UC en CD. Verder werden ook metingen van MMP-9 in feces geassocieerd met fecaal calprotectine en ziekte-activiteit in patiënten met UC.

De introductie van therapie met antistoffen gericht tegen TNF heeft een grote impact gehad op de huidige behandeling van patiënten met IBD. Waar vroeger het verdwijnen van symptomen als eindpunt van therapie werd aanzien, zijn nu volledige heling van de darmwand en een gedaald aantal operaties en hospitalisaties de eindpunten van behandeling. Echter, aangezien een derde van de patiënten niet reageert op de therapie of op termijn hun respons verliezen, zijn er nieuwe therapeutische doelwitten nodig. De auteurs van verscheidene studies suggereren dat MMP-9 een causale rol speelt in IBD en recent werd het therapeutisch potentieel om MMP-9 te blokkeren aangetoond in preklinische studies. Deze studies hebben ertoe geleid dat momenteel antagonisten van MMP-9 worden getest in fase 2 klinische studies van patiënten met zowel UC als CD.

Het eerste doel van dit doctoraatsproject was om de rol van MMPs en TIMPs verder te onderzoeken in IBD. Daarvoor hebben we de mucosale genexpressie van alle MMPs (n=23) en TIMPs (n=4) in biopsies van ileum en colon van zowel UC en CD patiënten met actieve ziekte voor en na de eerste behandeling met infliximab onderzocht (Hoofdstuk 3). Hierbij hebben we ontdekt dat de genexpressie van vele MMPs en TIMPs alsook de MMP/TIMP ratio’s verhoogd was bij IBD patiënten met actieve ziekte. Na behandeling met infliximab daalde de expressie van MMPs, TIMPs en de MMP/TIMP ratio’s bij patiënten met complete heling van de darmwand, terwijl dit niet het geval was bij patiënten zonder heling. Op eiwitniveau hebben we aangetoond dat de waarden van MMP-9 verhoogd waren in darmweefsel van IBD patiënten met actieve ziekte en dat deze waarden daalden na behandeling met infliximab bij patiënten met heling van de darmwand.

Het tweede doel van dit project was om te onderzoeken of MMP-9 als biomerker kan worden gebruikt om ziekte-activiteit of respons op behandeling vast te stellen in patiënten met IBD. Hiervoor hebben we eerst waarden van MMP-9 onderzocht in het serum van patiënten met UC voor en na behandeling met infliximab (Hoofdstuk 4). Met zymografie-analysen hebben we aangetoond dat voornamelijk het complex van MMP-9 met “neutrophil gelatinase B-associated lipocalin”/NGAL (NGAL-MMP-9) verhoogd was in het serum van UC patiënten met actieve ziekte in vergelijking met gezonde controlepersonen en dat het niveau van dit complex gedaald was in het serum van patiënten met heling van de darmwand na behandeling met infliximab. Deze resultaten werden bevestigd en verder gekwantificeerd met sandwich ELISA in dezelfde set serumstalen alsook in serumstalen van een onafhankelijke cohorte van patiënten met UC. Om deze nieuwe merker verder te valideren hebben we de waarden van NGAL-MMP-9 ook in het serum van patiënten met CD voor en na behandeling met infliximab gemeten waarbij gelijkaardige resultaten werden behaald (Hoofdstuk 5). Bovendien correleerden serum NGAL-MMP-9 waarden met endoscopische en histologische scores van ziekte-activiteit bij zowel patiënten met UC als CD. Uit onze data bleek dat NGAL-MMP-9 een betere merker is dan CRP om heling van de darmwand te onderscheiden. NGAL-MMP-9 kan daarom worden beschouwd als nieuwe biomerker voor IBD.

De derde doelstelling was om te onderzoeken of MMP-9 als nieuw therapeutisch doelwit kan worden beschouwd in IBD. In tegenstelling tot wat werd beschreven in eerdere studies hebben we geen vermindering van inflammatie in de darm geobserveerd in onze MMP-9 “knock-out”/KO muizen na acute behandeling met “dextran sodium sulphate”/DSS (Hoofdstuk 6). De MMP-9 KO muizen verloren niet minder gewicht, hadden een gelijkaardige graad van inflammatie in het colon alsook systemische inflammatie en de expressie van slechts 11 genen met een rol in antimicrobiële respons was verschillend in vergelijking met “wild-type”/WT muizen. De farmacologische inhibitie van MMP-9 door toediening van twee peptideremmers (A en B) met gekende anti-kanker en anti-endotoxine shock eigenschappen leidde bovendien niet tot vermindering van klinische of histopathologische parameters in muizen met acute darmontsteking. In tegenstelling observeerden we een verhoogde expressie van Mmp3, Mmp8 en Mmp9 in muizen met acute inflammatie die werden behandeld met peptideremmer B in vergelijking met zoutoplossing. Aangezien TIMP-1 de natuurlijke inhibitor is van MMP-9 is en een rol speelt in ontsteking van de darm en fibrose, hebben we de ontwikkeling van acute en chronische darmontsteking verder onderzocht in TIMP-1 KO muizen (Hoofdstuk 7). Na acute toediening van DSS zagen we dat TIMP-1 KO muizen verergerde darmontsteking en systemische inflammatie hadden, terwijl ze sneller herstelden met minder gewichtsverlies en ziekte-activiteit in vergelijking met WT muizen. Analysen van genexpressie toonden aan dat een groot aantal genen verschillend tot expressie werd gebracht in TIMP-1 KO en WT muizen met acute darmontsteking. Tot onze verbazing waren verscheidene immuungerelateerde genen reeds hoger tot expressie gebracht in TIMP-1 KO controle muizen in vergelijking met WT muizen, hetgeen de aanwezigheid van sub-inflammatoire omstandigheden suggereert in de TIMP-1 KO muizen. De genetische achtergrond van de TIMP-1 KO muizen alsook de MMP-onafhankelijke functies van TIMP-1 zouden een rol kunnen spelen in deze paradoxale resultaten. Na chronische toediening van DSS, werden verminderde darmontsteking alsook verminderde vorming van fibrose geobserveerd in TIMP-1 KO muizen in vergelijking met WT muizen. TIMP-1 kan hierdoor aanzien worden als een nieuw therapeutisch doelwit voor fibrose.

Ter conclusie, in dit doctoraatsproject hebben we aangetoond dat (i) de genexpressie van vele MMPs en TIMPs verstoord is bij IBD patiënten met actieve ziekte en dat deze wordt hersteld bij patiënten die volledige heling van de darmwand vertonen, (ii) (NGAL-)MMP-9 een excellente merker is voor ziekte-activieit en heling van de darmwand in IBD,(iii) huidige klinische studies met MMP-9 als therapeutisch doelwit voor IBD nauwlettend moeten worden opgevolgd en (iv) TIMP-1 als nieuw therapeutisch doelwit voor fibrose kan worden beschouwd.