RNA-splitsende DNAzymen: van karakterisering op het niveau van enkelvoudige moleculen tot het ontwikkelen van multiplex bioassays

De ontwikkeling van biosensoren is een multidisciplinaire uitdaging. Een performante biosensor is in staat een biomerker voor een bepaalde ziekte met hoge specificiteit, gevoeligheid en betrouwbaarheid op te sporen, maar is eveneens snel, goedkoop en makkelijk in gebruik.  Bovendien is het potentieel om meerdere biomerkers tegelijkertijd te detecteren – ook wel multiplexing genoemd - een groot voordeel in de medische diagnostiek.

In de zoektocht naar deze performante biosensoren zijn RNA-splitsende DNA-enzymen (RSD'en) aantrekkelijke kandidaten als bioherkenningselement dankzij hun hoge specificiteit, en als signaal-genererend element vanwege hun vermogen om het signaal te versterken door de splitsing van meerdere substraatsequenties. In deze context was het doel van dit proefschrift het potentieel van RSD’en te bestuderen als signaal-genererende elementen, zowel vanuit toepassings- als fundamenteel oogpunt met het ultieme doel beter presterende biosensoren te ontwikkelen.

In het eerste deel van dit werk werden RSD’en gebruikt in combinatie met aptameren (aptazymen) om hun potentieel aan te tonen voor de gelijktijdige detectie van eiwitten en NZ in eenzelfde staal met een grote specificiteit en nanomolaire detectielimieten. De ontwikkeling van deze multiplex bioassay leidde tot een methodologie om op rationele wijze nieuwe aptazymen te ontwerpen. Deze methodologie was gebaseerd op het vergelijken van de secundaire structuur van het RCD en het aptameer in het aptazym met hun individuele sequenties apart.

Het tweede deel van dit werk was gericht op een meer fundamentele studie van het werkingsmechanisme van de RSD’en met als doel toepassingen van RSD-gebaseerde biosensoren verder uit te breiden. Er werden twee benaderingen uitgewerkt voor de studie en karakterisatie van de splitsingsreacties gekatalyseerd door RSD’en.

In een eerste benadering werden de RSD’en bestudeerd in bulk met behulp van een wiskundig model dat werd ontwikkeld en geoptimaliseerd om de snelheidsconstante van elke reactiestap te schatten. Het resulterende model werd gebruikt om het tijdsverloop van reacties nauwkeurig te schatten voor een breed scala aan substraatconcentraties, temperaturen en cofactorconcentraties. Bovendien werd op basis van een gevoeligheidsanalyse aangetoond dat de splitsings- en associatiestappen de belangrijkste snelheidsbeperkende stappen van de reactie waren.

In een tweede benadering werd de reactiekinetiek van individuele RSD moleculen en de diversiteit ertussen bestudeerd met behulp van Förster Resonance Energy Transfer. De analyse van individuele RSD'en onder verschillende reactieomstandigheden maakte het onderscheid tussen splitsings- en niet-splitsingsgebeurtenissen mogelijk. De kwantificering van dergelijke gebeurtenissen werd gebruikt om de hoeveelheid actieve DNAzym-moleculen te bepalen. De resultaten toonden aan dat ongeacht de experimentele omstandigheden, ten minste 25% van de RSD’en aan het oppervlak inactief waren. Op basis van de splitsingsgebeurtenissen werd de substraatomzetting van elke RSD berekend, resulterend in een gemiddelde van 2,5 splitsingen per minuut. Desalniettemin wees de verdeling van waarden op een grote variabiliteit tussen DNAzymen.

Hoewel er nog heel wat uitdagingen zijn, vormen de resultaten die in dit proefschrift werden gerapporteerd een goede basis voor verder onderzoek in dit interessante domein.