Het gebruik van zebravis als een pre-klinisch model voor ADME studies

In het kader van lead optimalisatie en kandidaat selectie worden ADME-studies uitgevoerd om de dispositie van geneesmiddelen in een biologisch systeem te beschrijven. Hiervoor worden high-throughput screenings (HTS) uitgevoerd om ongeschikte kandidaten op een snelle manier uit te sluiten, waardoor tijd en geld bespaard worden door alleen inspanningen op de meest veelbelovende geneesmiddelen te concentreren. Verschillende modellen zijn momenteel beschikbaar voor het meten van de opname van drugs in de hersenen, maar geen van deze zijn momenteel in de farmacologische industrie aangenomen door verschillende nadelen. Zebravis (Danio rerio) kan gebruikt worden als een nieuw in vivo model, waardoor problemen die typisch voorkomen bij het gebruik van zoogdiermodellen en celculturen worden vermeden. Vooral hun hoge fecunditeit en kleine grootte maken zebravis interessant voor de farmaceutische industrie, aangezien slechts microgram-schaalhoeveelheden van verbindingen nodig zijn om HTS uit te voeren. In deze studie werd zebravis beoordeeld voor het doel van ADME-studies en vergeleken met andere recent ontwikkelde modellen, terwijl de nadruk werd gelegd op het gebruik van zebravis als predictief bloed-hersenbarrière model. Hiervoor werd eerst een geschikte extractiemethode voor biologische monsters ontwikkeld. Een staalvoorbereidingsprocedure voor 9 geneesmiddelen die een variëteit aan fysicochemische eigenschappen tonen, werd ontwikkeld met behulp van 10-dagen oude zebravissen (TG898). Voor een efficiënte homogenisatie van de monsters en de daaropvolgende recuperatie van de verbindingen uit de biologische monsters, werden verschillende hoeveelheden organische oplosmiddelen in combinatie met zure additieven toegevoegd aan zebravismonsters. Een verhouding van 1:2 (v/v) water:methanol in combinatie met 0,1% mierenzuur resulteerde in aanvaardbare recoveries tussen 74% en 100% voor alle verbindingen. Monsters werden vervolgens verwerkt met behulp van een krachtige sonicator en gecentrifugeerd. Supernatant werd verwijderd en verdampt in een vacuümoven voordat deze opnieuw in een mobiele fase-achtig oplosmiddel werd opgelost. Monsters werden geanalyseerd met behulp van ultra-hoge performante vloeistofchromatografie (UHPLC). Vervolgens werd de volledige opname van representatieve geneesmiddelen onderzocht door gebruik te maken van de toedieningsweg van immersie- en UHPLC-MS/MS-apparatuur om een eerste idee van de gevoeligheidseisen van de analytische methode te verkrijgen. Opmerkelijk was dat er maar één vis nodig was om de opname in het hele lichaam te meten. Twee extra geneesmiddelen werden gebruikt om drie verschillende toedieningsroutes te vergelijken: immersie, pericardiale- en dooierzak microinjecties. Deze experimenten toonden aan dat lichaamsconcentraties bereikt via injecties veel hoger zijn dan via langdurige immersie-experimenten, waardoor microinjecties beschouwd werden als een betrouwbaar hulpmiddel om de farmacokinetiek in zebravis voor hydrofiele geneesmiddelen te bestuderen. Tenslotte werd een hersendissectietechniek ontwikkeld om de hersenopname van de gekozen farmaceutische middelen met behulp van capillaire UHPLC te meten. Hiervoor werden zebravissen afzonderlijk geïncubeerd met 7 geneesmiddelen via de route van immersie. De concentratie die de hersenen bereikte, werd bepaald door toepassing van een nieuwe hersen-extractie procedure. Monsteranalyse werd uitgevoerd door middel van capillaire ultra-hoge performante vloeistofchromatografie in combinatie met een variabele golflengte UV detector. Kwantitatieve experimenten werden uitgevoerd op gepoolde stalen van zes zebravissen (n=6) en toonden de semipermeabele aard van de bloed-hersenbarrière aan, nadat de vissen werden geïncubeerd met de maximum tolereerbare concentratie van de geneesmiddelen.