Onderzoek naar de genetische en fenotypische diversiteit in Brettanomyces gisten

Brettanomyces gisten, met Brettanomyces (Dekkera) bruxellensis als belangrijkste soort, worden over het algemeen als bederforganismen beschouwd voor de bier- en wijnindustrie ten gevolge van de productie van fenolische off-flavors. De betrokken geuren, die vaak als medicinaal, leerachtig of dierlijk worden omschreven (ook bekend als het “Brett karakter”), zijn doorgaans negatief voor de bier- en wijnkwaliteit. Dezelfde componenten hebben echter ook een essentiële bijdrage in sommige fermentatieprocessen, zoals de productie van lambiek en geuze. Ondanks het economisch belang van de gist was bij aanvang van dit doctoraat nog maar weinig gekend over de biologie, fysiologie en ecologie van Brettanomyces. In dit doctoraatsonderzoek werden verschillende aspecten bestudeerd die bijdragen tot een beter begrip van de biologie en ecologie van Brettanomyces gisten, met een bijzondere aandacht voor B. bruxellensis.

            In het eerste hoofdstuk (Hoofdstuk I) geven we een overzicht van de huidige state-of-the-art in Brettanomyces onderzoek, met in het bijzonder nadruk op die facetten die in dit proefschrift worden onderzocht. Deze omvatten aspecten verbonden aan aromaproductie en methoden voor detectie en identificatie van de gist. Verder richten we ons op recente genetische en genomische studies die vernieuwende evolutionaire inzichten brachten voor B. bruxellensis. In Hoofdstuk II onderzochten we met behulp van gevestigde DNA-fingerprinting methoden de (fylo)genetische verwantschappen tussen 50 stammen van alle gekende Brettanomyces soorten afkomstig van verschillende voedingsmiddelen en dranken. Tot de gebruikte methoden behoorden sequenering van de ribosomaal RNA (rRNA) genen, random amplified polymorphic DNA (RAPD) PCR, arbitrarily primed (AP) PCR en repetitive element PCR fingerprinting (rep-PCR). Onze resultaten bevestigden eerdere bevindingen: Brettanomyces gisten vormen een genetisch diverse tak met verschillende subgroepen, zelfs binnen eenzelfde soort. Verder onthulden onze resultaten een intrigerende correlatie tussen de verschillende B. bruxellensis genotypes en hun respectievelijke herkomst (niche), wat niche adaptie suggereert. Om deze relatie verder te onderzoeken, werd het genoom van een nuttige bierstam gesequeneerd (VIB X9085; ST05.12/22) en vergeleken met de genoomsequenties van twee wijn bederfstammen (AWRI 1499 en CBS 2499) (Hoofdstuk III). Naast stam-specifieke single nucleotide polymorphisms (SNPs) en DNA inserties/deleties (InDels) werd structurele genoomvariatie vastgesteld tussen onze stam en beide wijnstammen, waarbij opvallend een aantal regio’s afwezig waren in het genoom van de bierstam. Deze gebieden omvatten bijvoorbeeld een regio waarop de B. bruxellensis nitraatassimilatie gencluster gelokaliseerd is en een cluster met genen hoofdzakelijk betrokken in het koolstofmetabolisme. Vervolgens werden in Hoofdstuk IV metabolische verschillen in koolstof- en stikstofassimilatie tussen verschillende B. bruxellensis stammen geïsoleerd uit bier, frisdrank en wijn grondig bestudeerd met behulp van Biolog Phenotype Microarrays. Terwijl een aantal fysiologische gelijkenissen tussen de gisten werd vastgesteld, bleken vele eigenschappen ook variabel te zijn tussen de stammen. Interessant is dat bepaalde fenotypen konden gekoppeld worden aan de herkomst van de stam (bier, wijn of frisdrank), vooral voor de assimilatie van bepaalde α- en β-glycosiden en α- en β-gesubstitueerde monosachariden blijkt deze link aanwezig. Op basis van aan- of afwezigheid van genen werden een α-glucosidase en een β-glucosidase gecorreleerd aan de waargenomen fenotypes. Verder werd dankzij een PCR screening op een groot aantal B. bruxellensis isolaten een deletie in het genoom (met daarop onder meer een β-glucosidasegen) specifiek gelinkt aan bierstammen, wat suggereert dat deze regio in bepaalde fermentatiesystemen, zoals het brouwen van lambierbieren, een fitness kost voor B. bruxellensis betekent. Verder toonde ons werk aan dat de meeste bierstammen diploïd zijn, terwijl het merendeel van de wijnstammen triploïd is. Dit suggereert dat de derde set chromosomen voor bepaalde stammen in omgevingen zoals wijn een selectief voordeel kan opleveren. Tenslotte werden in Hoofdstuk V een reeks fermentatietesten uitgevoerd, waarbij verschillende B. bruxellensis stammen werden geënt in media representatief voor verschillende ecologische niches van de gisten (bijvoorbeeld bier, wijn en frisdrank). Na een maand fermentatie werd het gebruik van verschillende suikers bepaald, net zoals de productie van verschillende vluchtige componenten. Onze resultaten tonen aan dat niet alleen het medium (met mogelijk verschillende precursors aanwezig), maar ook de giststam invloed heeft op de vorming van het typische Brettanomyces karakter van het aroma. Bovendien werd een (matige) correlatie gevonden tussen de oorsprong van de stammen en hun impact op de vluchtige samenstelling van de media. Bijvoorbeeld, alleen stammen oorspronkelijk geïsoleerd uit wijn produceerden de typische Brettanomycesoff-flavors wanneer ze geënt werden in wijn, terwijl stammen oorspronkelijk geïsoleerd uit bier of frisdrank zulke aroma’s niet vormden. Vice versa, in het Belgische speciaalbier Duvel gedroegen de bierstammen zich verschillend van de overige stammen. Globaal suggereren deze resultaten dan ook dat de interactie tussen medium en stam de uitkomst van de aroma productie bepaalt.

Alles tezamen levert deze doctoraatsstudie tools om Brettanomyces stammen te onderscheiden, en werpt ze een eerste blik op de genetische diversiteit, en genomische en fenotypische plasticiteit van B. bruxellensis. Onze bevindingen zijn relevant voor de wijn- en bierindustrie. Een beter begrip van de ecologie van B. bruxellensis levert immers niet alleen nieuwe inzichten op in de evolutie van deze economisch belangrijke gist, maar ook inzichten om wijnbederf door B. bruxellensis tegen te gaan of het bierproces van lambiek en geuze te verbeteren.