Systematische zoektocht naar nieuwe defecten en een klinische vergelijking van congenitale glycosylatiestoornissen type 1 (CDG-I).

Glycosylatie is één van de meest voorkomende post-translationele modificaties in de natuur. Glycosylatie is het resultaat van een goed gecoördineerde samenwerking tussen eiwitten die instaan voor de opbouw en modificatie van oligosachariden en voor hun aanhechting aan eiwitten en lipiden. Het belang van glycosylatie wordt geïllustreerd door een groep van aandoeningen, genaamd Congenitale glycosylatiestoornissen (CDG). Vandaag de dag zijn er bijna 100 verschillende aandoeningen gekend, waarbij zowel defecten in de N- en O-gebonden eiwit glycosylatie, als defecten in de synthese van GPI-ankers en glycolipiden werden gedocumenteerd. Gezien de mogelijkheid bestaat om te screenen voor deficiënties in de N-gebonden eiwit glycosylatie door middel van isoelektrische focusering van serum transferrine, richtte dit project zich op deze subgroep van aandoeningen.

De genetische heterogeniteit van CDG, maar ook de klinische overlap tussen de verschillende aandoeningen is merkwaardig. Een klinische ‘hit and run’ diagnose vormt bijgevolg dus eerder de uitzondering dan de regel. Daarom is het ook moeilijk om in patiënten met een biochemisch bewezen glycosylatie defect, de genetische oorzaak te achterhalen. In dit manuscript probeerden we het knelpunt, gevormd door gen per gen na te kijken door middel van Sanger sequencing, te omzeilen met behulp van de nieuwe generatie van genetische technieken (Hoofdstuk 3).

Met het doel om nieuwe CDG genen te ontdekken, werd exoom sequenering uitgevoerd in 24 personen met een verondersteld defect in de N-gebonden eiwit glycosylatie (Hoofdstuk 4 en 5). Telkens een genetische variant werd geïdentificeerd, werd de pathogeniciteit bevraagd door middel van celbiologische experimenten. Op deze manier werd een genetische diagnose verkregen in 9 patiënten (38%) en werd een kandidaat gen geïdentificeerd in 7 patiënten (30%).

Gelijktijdig werd een doelgerichte test ontwikkeld die 79 genen gelijktijdig kan nakijken op varianten, om zo de efficiëntie van de CDG diagnostiek te bevorderen (Hoofdstuk 6). Gedurende een periode van 2 jaar, werd de test toegepast op stalen van 86 patiënten met een verondersteld defect in de N-gebonden eiwit glycosylatie. Op deze manier kon relatief snel een definitieve genetische diagnose gesteld worden in 38 patiënten (44%). Op basis van deze resultaten werd een nieuw stroomdiagram voor CDG diagnostiek voorgesteld.

In deze studie leidde exoom sequenering eveneens tot de identificatie van een nieuwe CDG-II, veroorzaakt door mutaties in MAN1B1. Op basis van de biochemische afwijkingen geobserveerd in de index, werden 18 bijkomende patiënten gediagnosticeerd met mutaties in hetzelfde gen. Alle patiënten vertoonden gelijkaardige klinische kenmerken zoals mentale retardatie, vertraagde motorische en spraakontwikkeling, hypotonie, macrocefalie en obesitas.

Tijdens het verloop van dit doctoraat, werd de intracellulaire lokalisatie van MAN1B1 het onderwerp van een nog steeds lopend debat. Naast de functie van MAN1B1 in de maturatie van N-glycanen, wordt dit enzym ook verondersteld een belangrijke rol te spelen in de kwaliteitscontrole binnen het ER, door foutief geplooide eiwitten te markeren voor proteasomale degradatie. Aangezien alle andere spelers van ERAD zich in het ER bevinden, leek het niet meer dan logisch dat ook MAN1B1 zijn functie in dit organel zou uitvoeren. Vandaag de dag zijn de meningen hieromtrent echter verdeeld. Daar waar sommige onderzoekers nog steeds geloven dat MAN1B1 zich in het ER bevindt, zijn anderen ervan overtuigd dat het enzym functioneert in een verondersteld ERQC compartiment of zelfs in het Golgi apparaat.

In Hoofdstuk 9 hebben we duidelijk kunnen aantonen, dat in primaire huidfibroblasten endogeen MAN1B1 in het Golgi apparaat gelokaliseerd is. Hiermee bevestigden we de initiële, doch nog steeds controversiële resultaten van Sifers en zijn collega’s. Onze bevindingen werden bijkomend ondersteund door de observatie dat MAN1B1-deficiënte fibroblasten een abnormale Golgi structuur vertonen en dit zonder de aanwezigheid van een stress reactie in het ER (Hoofdstuk 8 en 9).

In het verleden werden MAN1B1-deficiënte cellen voornaam gebruikt om het lot van verkeerd geplooide eiwitten te bestuderen. Met betrekking tot het fenotype van MAN1B1-CDG waren we echter voornaam geïnteresseerd in de gevolgen van MAN1B1-deficiëntie op correct geplooide eiwitten (Hoofdstuk 9). Op deze manier konden we aantonen dat MAN1B1-deficiëntie niet alleen leidt tot de accumulatie en partiële secretie van foutief geplooide eiwitten, maar dat deze deficiëntie ook het anterograad transport van correct geplooide eiwitten negatief beïnvloedt.

In Hoofdstuk 10 van dit manuscript veronderstelden we dat de bovengenoemde accumulatie van al dan niet correct geplooide eiwitten in het Golgi apparaat de secretoire capaciteit van dit organel zou kunnen belasten, resulterend in een primaire Golgi stress respons. Op basis van verschillende pilootexperimenten konden we aantonen, dat MAN1B1-deficiëntie een milde tot matige transcriptionele respons genereert, die niet enkel uniform aanwezig was tussen de verschillende MAN1B1 patiënten onderling, maar die ook verschillend was van de respons die in andere CDG-II cellijnen waargenomen werd. Aanvullende experimenten dienen in de toekomst uitgevoerd te worden om de omvang van een eventuele Golgi stress respons in MAN1B1-CDG te beschrijven en om de eventuele impact van deze respons op de behandeling van MAN1B1-CDG patiënten te kunnen evalueren.