γ-Secretase structuur-functie studies door middel van Nanobodies

Synopsis: γ-Secretases (GSECs) zijn intra-membraan splitsende proteasen (I-CLiPs) die betrokken zijn bij essentiële fysiologische signaalcascades en ziekteprocessen. GSEC's bestaan uit vier essentiële subeenheden, met name nicastrine (NCSTN), anterieure farynx defect 1 (APH1), presenilineversterker 2 (PEN-2) en de katalytische subeenheid preseniline (PSEN). Doorgaans zijn substraten van GSEC’s type I single-pass transmembraaneiwitten zoals bijvoorbeeld amyloïde precursoreiwit (APP) of Notch-receptoren. Een sequentiële GSEC-gemedieerde proteolyse van het APP leidt tot amyloïde-β-peptiden (Aβ) met verschillende lengtes. Een accumulatie van de langere Aβ-peptiden is gekend als een vroeg pathologisch kenmerk in de ziekte van Alzheimer (AD). De AD-veroorzakende mutaties in PSEN of APP zorgen voor een toename in productie van de langere en meer aggregatiegevoelige Aβs waarbij wordt aangenomen dat de toxiciteit gemedieerd is door oligomerisatie. Ondanks het bewijs dat GSECs verantwoordelijk zijn voor de generatie van pathogene Aβ-peptiden is er zeer weinig bekend over het onderliggende moleculaire mechanisme waarbij GSEC-gemedieerde sequentiële proteolyse van APP de lengte van de Aβ-peptiden definieert. De huidige stand van zaken in de wetenschap: mechanistische inzichten in de biologische processen en cascades gemedieerd door GSECs zouden een beter inzicht kunnen geven in de pathogenese van AD en een richting kunnen geven voor een klinisch target van dit fascinerende enzym. Doelstellingen van dit project: I Het ontcijferen van de moleculaire grondslagen van de sequentiële GSEC-knipping van APP die de Aβ-peptide lengte definieert. II Ontrafelen van de structurele en moleculaire fundamenten van GSEC-modulatoren (GSMs). Belangrijkste bevindingen: I. Voorgaande studies, zowel door anderen als door ons, hebben de extracellulaire GSEC-APP/ Aβ-interface geïdentificeerd als belangrijke factor voor GSEC-proteolyse. Hoewel verschillende residuen in APP, met name in het extracellulaire of juxtamembraangedeelte (Lys28, Asn27, Gly29, Gly33, Aβ-nummering) en GSEC (NCSTN-I242), van groot belang bleken te zijn voor de sequentiële proteolyse van Aβ bleven de bijbehorende moleculaire mechanismen grotendeels ongrijpbaar. We hebben ontdekt dat hydrophobe mutaties in het substraat-ectodomein (ECD) zowel de efficiëntie als de omvang van de sequentiële proteolyse van APP door GSEC’s verhogen. Met onze mutagenese screening hebben we ontdekt dat polaire interacties die tot stand worden gebracht door het APP-ECD, waarbij Lys28 en Asp23 betrokken zijn maar niet beperkt door deze twee, de GSEC-processiviteit beperken en de product afgifte stimuleren door de enzym-substraat (E-S) interacties te destabiliseren. We hebben namelijk ontdekt dat de stimulerende effecten op product afgifte van de polaire ECD van het substraat een algemeen mechanisme is die ook de Notch-verwerking controleert. Bovendien toonden onze analyses aan dat de mitigatie van de hydrofiele APP-ECD door hydrofobe mutaties de effecten van de AD-veroorzakende mutaties in zowel PSEN en APP kan tegengaan. Hierdoor wordt de ontwikkeling van lange Aβ-peptiden tenietgedaan en de GSEC-activiteit hersteld. Dit toont aan dat de efficiëntie van de sequentiële GSEC-proteolyse grotendeels wordt bepaald door het substraat. Daarnaast hebben we het werkingsmechanisme (MOA) onderzocht van GSEC-remmers (GSI's) waarvan is aangetoond dat ze 'pathogene mutatie-nabootsende' effecten uitoefenen: gedeeltelijke remming van de algehele GSEC-activiteit en verhoogde productie van langere Aβ-soorten. We laten zien dat DAPT en semagacestat GSI's functioneren als concurrenten met hoge affiniteit voor substraten. De bezetting van het substraatbindende kanaal door deze GSI's blokkeert de toegang tot het substraat of verdringt peptiden die al aan GSEC gebonden zijn en proteolyse hebben ondergaan. De meer effectieve verplaatsing van kortere Aβs met de lagere affiniteit tijdens de sequentiële proteolyse verklaart de eerder aangetoonde paradoxale “pathogene mutatie-nabootsende” toename in langere Aβs. Onze analyses tonen aan dat een beperking van de product afgifte, door het verhogen van de hydrofobiciteit in de APP-ECD, de GSI activiteit belemmerde. Dit ondersteunt het idee van “competitieve” remming door deze verbindingen en toont de betrokkenheid van het substraat-ECD aan bij product afgifte. Kort samengevat, onze onderzoeken identificeren het extracellulaire/luminale substraatgebied als aanstuurder van GSEC-proteolyse door de controle van de product afgifte. II. Vanwege hun stimulerende effecten op de productie van korte Aβ-peptiden ten koste van langere soorten zijn GSM’s een veelbelovende kandidaat als geneesmiddel om AD te bestrijden. Desalniettemin is de interactie tussen geneesmiddelen en hun doelwit nog steeds slecht gedefinieerd, wat zorgt voor een belemmering in de ontwikkeling van efficiënte en specifieke verbindingen die uiteindelijk bij patiënten worden toegepast. Recente cryo-EM structurele data van GSEC in complex met een GSM’s werpen licht op belangrijke moleculaire GSEC-GSM-interacties. De biologisch relevante interacties van GSM's met GSEC gebonden aan APP/Aβ bleven echter nog steeds ongrijpbaar. Door structuur-gestuurde biochemie en moleculaire modellering te combineren ontdekten we dat op imidazol gebaseerde GSM's zich richten op de E-S-interface. Belangrijk is dat onze gegevens aantonen dat de binding van het imidazoolgedeelte van het medicijn aan een (sub)pocket in PSEN een dubbel werkingsmechanisme uitoefent: allosterische enzymactivering en stabilisatie van ES-interacties.