< Terug naar vorige pagina
Project
Ontwikkeling en validatie van actieve en passieve immunotherapie gericht tegen het eiwit Tau in transgene muis modellen voor de ziekte van Alzheimer.
Wereldwijd lijden meer dan 30 miljoen mensen aan de ziekte van Alzheimer (AD), de meest voorkomende en prominente vorm van dementie. Verwacht wordt dat dit aantal nog verviervoudigd tegen 2050, als gevolg van de vergrijzing van onze samenleving, dankzij verbeterde hygiëne en medische zorg.
Patiënten met AD zijn, zelfs voor de dagdagelijkse taken, afhankelijk van de hulp en goede zorgen van anderen. Dit betekent een grote financiële en emotionele belasting, niet enkel voor echtgenoten en familieleden maar voor de volledige samenleving.
Meer dan 100 jaar geleden werden de klinische en neuropathologische kenmerken van AD voor het eerst beschreven door de Duitse professor Alois Alzheimer. Nog steeds blijven vele vragen over de achterliggende moleculaire mechanismen onbeantwoord en is er nog geen genezing mogelijk. Verder onderzoek is hoogst noodzakelijk naar technieken die een snellere diagnose en effectieve behandeling mogelijk maken zodat AD in de toekomst voorkomen en/of genezen kan worden.
Naast neuroinflammatie wordt AD vooral gekenmerkt door de aggregatie van misgevouwen amyloïd peptiden en Tau eiwitten. Deze vormen respectievelijk de extracellulaire amyloïde of senile plakken, en de intracellulaire neurofibrillaire tangles en neuropil threads. De exacte synergie tussen amyloïden Tau pathologie is nog steeds onduidelijk. Verschillende genetische, pathologische en experimentele waarnemingen bevestigen echter dat Tau pathologie van essentieel belang is in de ontwikkeling van AD en niet louter een neveneffect. De werkhypothese van de LEGTEGG onderzoeksgroep omvat dan ook zowel de amyloïd als de Tau pathologie. Volgens deze hypothesewordt de opeenvolging van gebeurtenissen, die uiteindelijk leiden tot geheugenverlies en cognitieve achteruitgang, geïnitieerd door een overmaat aan amyloïd peptiden. Deze peptiden activeren verschillende kinasen waarvan GSK3 als de belangrijkste speler tussen amyloïd en Tau pathologie wordt gezien. Door de abnormaal hoge kinase activiteit wordt het Tau eiwit abnormaal gefosforyleerd. Hierdoor is het meer vatbaar voor zelfaggregatie en dit leidt uiteindelijk tot Tau pathologie. Als gevolg hiervan worden synaptische en neuronale functies vernietigd wat uiteindelijkresulteert in neurodegeneratie en dementie. Naast hun bijdragen aan de pathologie van AD moeten ook de normale functies van amyloïd peptiden indien bestaande en het Tau eiwit in de neuronale mechanismen die instaan voor leren en geheugen, nog opgehelderd worden.
De aanwezigheid van aggregaten van het Tau eiwit in de neuronale soma en neuriten is evenredig met de graad van cognitieve achteruitgang bij dementerende patiënten. Transgene muizen met Tau pathologie vertonen echter al geheugenstoornissen voordat Tau aggregaten waargenomen kunnen worden in de hersenen. Dit duidt er op dat deze grote fibrillaire aggregaten niet verantwoordelijk zijn voor de cognitieve regressie maar eerder een gevolg zijn van de onderliggende Tau pathologie. De werkelijke neurotoxische entiteiten zijn hoogst waarschijnlijk tussenproducten die ontstaan tijdens het aggregatie proces van een enkel Tau molecule tot grote fibrillaire aggregaten. Deze toxische entiteiten worden door ons aangeduid als TauP* maar de exacte biochemische kenmerken zijn hiervan nog niet volledig opgehelderd. De verdere karakterisering van TauP* en het ophelderen van de mechanismen die leiden tot zijn vorming, zouden een grote stap voorwaarts betekenen in het ontrafelen van de ziekte van Alzheimer en het definiëren van nieuwe doelwitten voor therapeutische behandelingen.
De doelstelling van dit proefschrift is tweevoudig: enerzijds het ontrafelen van de moleculaire kenmerken van TauP* en de oorzakenen gevolgen van Tau pathologie, en anderzijds de ontwikkeling en validatie van immunotherapie gericht tegen Tau pathologie. Voor beide doelen werd gebruik gemaakt van de verschillende transgene muismodellen voor tauopathie en AD die ontwikkeld werden in de LEGTEGG onderzoeksgroep.
Voor het karakteriseren van TauP* werd de Tau pathologie eerst in het Tau.P301L muismodel bestudeerd. Daarna werd dit model vergeleken met twee bigene muismodellen, genaamd biAT en biGT, respectievelijkmodellen voor AD en frontotemporale dementie. De bigene muismodellen brengen hetzelfde Tau.P301L transgen tot expressie, maar in combinatie metAPP.V717l in biAT en GSK3β in biGT muizen. Onze observaties duidenop een belangrijk verband tussen biochemische en pathologische parameters in de voorhersenen en de hersenstam. De voorhersenen zijn, met hippocampus en cortex, essentieel voor leren en het geheugen, terwijl de hersenstam de onvrijwillige fysiologische acties zoals hartslag en ademhalingregelt.
Tau pathologie in de hersenstam van Tau.P301L muizen veroorzaakt afwijkingen in de bovenste luchtwegen wat aanleiding geeft tot de vroegtijdige dood van deze muizen. Hier hebben we aangetoond dat een zeer vergelijkbare Tau pathologie optreedt in de hersenstam van terminale biGT muizen, maar dan op latere leeftijd. Via biochemischeanalyse werd de fosforylatie van het Tau eiwit op aminozuren Ser262 en Ser396 geïdentificeerd als mogelijke rede voor de uitgestelde vorming van Tau aggregaten in de hersenstam van biGT muizen. Ser396 is een substraat van GSK3β. Het later verschijnen van Tau aggregaten in de hersenstam zorgde ervoor dat deze muizen langer leefden maar tegelijkertijd ook aanzienlijk meer Tau pathologie ontwikkelde in de voorhersenen. In oude biAT muizen zorgt eveneens een verminderde aggregatie van het Tau eiwit in de hersenstam voor een langere levensverwachting van deze muizen. Dit is tegenstrijdig met het grote aantal biAT muizen dat sterft op jongeleeftijd, vermoedelijk omwille van epileptische problemen. Merk op dat ook patiënten met AD gevoelig zijn voor epileptische aanvallen, wat betekent dat de biAT muizen meer kenmerken vertonen van AD dan enkel de gecombineerde amyloïd en Tau pathologie.
Verdere biochemische analyse van Tau in de verschillendetransgene muismodellen bevestigtdat de meest waarschijnlijke kandidaten voor TauP*, kleine oligomeren van Tau zijn waarin het eiwit zich in een conformatie bevindt die specifiek is voor Tau pathologie. De ontwikkelde sandwich ELISA met de antilichamen MC1 en TN5-20 detecteert Tau in een abnormale conformatie terwijl desandwich ELISA met het antilichaam TN5-20, voor zowel captatie als detectie, aggregaten van het Tau eiwit detecteert. Beide ELISAs gaven gelijkaardige resultaten bij analyse van de hersenen van de verschillende muizen op diverse leeftijden en met uiteenlopende klinische aandoeningen. Bovendien komen de ELISA gegevens overeen met de 68 kDa Tau isovorm in westernblot die kenmerkend is voor Tau pathologie en als kandidaat voor TauP* wordt beschouwd. Omdat er geen grote kwalitatieve verschillen in de fosforylatie van Tau werden gevonden in de voorhersenen en de hersenstam tussen pre-symptomatische, klinisch zieke en terminale Tau.P301L en biGTmuizen, blijven de exacte moleculaire oorzaken voor de vorming van TauP* nog onduidelijk. Verschillende posttranslationele modificaties van Tauwerden in acht genomen, met fosforylatie als meest beduidend. O-GluNac-ylatie van Tau werd in een parallel project al uitgesloten. In eerste instantie werd de algemene graad van fosforylatie geanalyseerd, die van belang is voor de initiatie van Tau pathologie. Later werden ook specifiekere combinaties van fosfo-epitopen geëvalueerd. Echter, met 45 serines, 35 threonines en 5 tyrosines aanwezig in de aminozuur sequentie van het Tau eiwit betekent dit een overvloed van mogelijke combinaties en van potentiële kinasen. Verder biochemisch onderzoek is nog bezig met o.a. nieuwe ontwikkelde antilichamen die specifiek zijn voor de conformatie en de fosforylatie van Tau.
Op basis van de gepostuleerdeamyloïd cascade hypothese werden therapeutische benaderingen voornamelijk gebaseerd op de amyloïd peptiden. Veel van deze benaderingen faalden echter in klinische studies omdat ze niet voldoende effectief waren of ernstige bijwerkingen vertoonden. Daardoor worden nu ook tal van andere behandelingsstrategieën ontwikkeld gebaseerd op andere pathologische doelwitten of gebeurtenissen. Deze worden onderzocht in preklinische studies in transgene muismodellen.
Het tweede deel van dit promotieonderzoek was gericht op de ontwikkeling, evaluatie en validatie van (i) actieve immunotherapy met op liposoom-gebaseerde vaccins die synthetische pathologische fosfo-Tau peptiden dragen en (ii) passieve immunotherapie met nieuwe ontwikkelde monoklonale antilichamen. Tau als doelwit, betekent dat niet enkel een behandeling van AD mogelijk wordt maar ook van de vele primaire Tau pathologieën. Zowel actieve als passieve immunotherapie bleek effectief in het verminderen van gefosforyleerd Tau in Tau.P301L en biGT muismodellen. Bovendien verminderde actieve immunotherapie in Tau.P301L muizen, althans gedeeltelijk, de vorming van grotere fibrillare aggregaten in de voorhersenen van deze muizen.
Naast de doeltreffendheid van de therapieën waren we ook uitermate geïnteresseerd in de veiligheid van beide strategieën, maar in het bijzonder van actieve vaccinatie. De liposomale vaccins bleken niet toxisch te zijn zelfs na herhaaldelijke toediening. Dit werd aangetoond door de verbeterde klinische conditie van de muizen, maar voornamelijk door de afwezigheid van neuro-inflammatie en door het feit dat de liposomale vaccins de ontwikkeling van antilichamen kunnen initiëren onafhankelijk van de activatie van T-cellen.
De gecombineerde resultaten van de experimentele actieve en passieve immunotherapieën in de LEGTEGG muismodellen voor tauopathie laten ons toe om voorzichtig optimistisch te zijn over hun potentieel voor de behandeling van primaire tauopathieën en de ziekte van AD, hetzij alleen, hetzij in combinatie met andere therapeutische benaderingen.
Patiënten met AD zijn, zelfs voor de dagdagelijkse taken, afhankelijk van de hulp en goede zorgen van anderen. Dit betekent een grote financiële en emotionele belasting, niet enkel voor echtgenoten en familieleden maar voor de volledige samenleving.
Meer dan 100 jaar geleden werden de klinische en neuropathologische kenmerken van AD voor het eerst beschreven door de Duitse professor Alois Alzheimer. Nog steeds blijven vele vragen over de achterliggende moleculaire mechanismen onbeantwoord en is er nog geen genezing mogelijk. Verder onderzoek is hoogst noodzakelijk naar technieken die een snellere diagnose en effectieve behandeling mogelijk maken zodat AD in de toekomst voorkomen en/of genezen kan worden.
Naast neuroinflammatie wordt AD vooral gekenmerkt door de aggregatie van misgevouwen amyloïd peptiden en Tau eiwitten. Deze vormen respectievelijk de extracellulaire amyloïde of senile plakken, en de intracellulaire neurofibrillaire tangles en neuropil threads. De exacte synergie tussen amyloïden Tau pathologie is nog steeds onduidelijk. Verschillende genetische, pathologische en experimentele waarnemingen bevestigen echter dat Tau pathologie van essentieel belang is in de ontwikkeling van AD en niet louter een neveneffect. De werkhypothese van de LEGTEGG onderzoeksgroep omvat dan ook zowel de amyloïd als de Tau pathologie. Volgens deze hypothesewordt de opeenvolging van gebeurtenissen, die uiteindelijk leiden tot geheugenverlies en cognitieve achteruitgang, geïnitieerd door een overmaat aan amyloïd peptiden. Deze peptiden activeren verschillende kinasen waarvan GSK3 als de belangrijkste speler tussen amyloïd en Tau pathologie wordt gezien. Door de abnormaal hoge kinase activiteit wordt het Tau eiwit abnormaal gefosforyleerd. Hierdoor is het meer vatbaar voor zelfaggregatie en dit leidt uiteindelijk tot Tau pathologie. Als gevolg hiervan worden synaptische en neuronale functies vernietigd wat uiteindelijkresulteert in neurodegeneratie en dementie. Naast hun bijdragen aan de pathologie van AD moeten ook de normale functies van amyloïd peptiden indien bestaande en het Tau eiwit in de neuronale mechanismen die instaan voor leren en geheugen, nog opgehelderd worden.
De aanwezigheid van aggregaten van het Tau eiwit in de neuronale soma en neuriten is evenredig met de graad van cognitieve achteruitgang bij dementerende patiënten. Transgene muizen met Tau pathologie vertonen echter al geheugenstoornissen voordat Tau aggregaten waargenomen kunnen worden in de hersenen. Dit duidt er op dat deze grote fibrillaire aggregaten niet verantwoordelijk zijn voor de cognitieve regressie maar eerder een gevolg zijn van de onderliggende Tau pathologie. De werkelijke neurotoxische entiteiten zijn hoogst waarschijnlijk tussenproducten die ontstaan tijdens het aggregatie proces van een enkel Tau molecule tot grote fibrillaire aggregaten. Deze toxische entiteiten worden door ons aangeduid als TauP* maar de exacte biochemische kenmerken zijn hiervan nog niet volledig opgehelderd. De verdere karakterisering van TauP* en het ophelderen van de mechanismen die leiden tot zijn vorming, zouden een grote stap voorwaarts betekenen in het ontrafelen van de ziekte van Alzheimer en het definiëren van nieuwe doelwitten voor therapeutische behandelingen.
De doelstelling van dit proefschrift is tweevoudig: enerzijds het ontrafelen van de moleculaire kenmerken van TauP* en de oorzakenen gevolgen van Tau pathologie, en anderzijds de ontwikkeling en validatie van immunotherapie gericht tegen Tau pathologie. Voor beide doelen werd gebruik gemaakt van de verschillende transgene muismodellen voor tauopathie en AD die ontwikkeld werden in de LEGTEGG onderzoeksgroep.
Voor het karakteriseren van TauP* werd de Tau pathologie eerst in het Tau.P301L muismodel bestudeerd. Daarna werd dit model vergeleken met twee bigene muismodellen, genaamd biAT en biGT, respectievelijkmodellen voor AD en frontotemporale dementie. De bigene muismodellen brengen hetzelfde Tau.P301L transgen tot expressie, maar in combinatie metAPP.V717l in biAT en GSK3β in biGT muizen. Onze observaties duidenop een belangrijk verband tussen biochemische en pathologische parameters in de voorhersenen en de hersenstam. De voorhersenen zijn, met hippocampus en cortex, essentieel voor leren en het geheugen, terwijl de hersenstam de onvrijwillige fysiologische acties zoals hartslag en ademhalingregelt.
Tau pathologie in de hersenstam van Tau.P301L muizen veroorzaakt afwijkingen in de bovenste luchtwegen wat aanleiding geeft tot de vroegtijdige dood van deze muizen. Hier hebben we aangetoond dat een zeer vergelijkbare Tau pathologie optreedt in de hersenstam van terminale biGT muizen, maar dan op latere leeftijd. Via biochemischeanalyse werd de fosforylatie van het Tau eiwit op aminozuren Ser262 en Ser396 geïdentificeerd als mogelijke rede voor de uitgestelde vorming van Tau aggregaten in de hersenstam van biGT muizen. Ser396 is een substraat van GSK3β. Het later verschijnen van Tau aggregaten in de hersenstam zorgde ervoor dat deze muizen langer leefden maar tegelijkertijd ook aanzienlijk meer Tau pathologie ontwikkelde in de voorhersenen. In oude biAT muizen zorgt eveneens een verminderde aggregatie van het Tau eiwit in de hersenstam voor een langere levensverwachting van deze muizen. Dit is tegenstrijdig met het grote aantal biAT muizen dat sterft op jongeleeftijd, vermoedelijk omwille van epileptische problemen. Merk op dat ook patiënten met AD gevoelig zijn voor epileptische aanvallen, wat betekent dat de biAT muizen meer kenmerken vertonen van AD dan enkel de gecombineerde amyloïd en Tau pathologie.
Verdere biochemische analyse van Tau in de verschillendetransgene muismodellen bevestigtdat de meest waarschijnlijke kandidaten voor TauP*, kleine oligomeren van Tau zijn waarin het eiwit zich in een conformatie bevindt die specifiek is voor Tau pathologie. De ontwikkelde sandwich ELISA met de antilichamen MC1 en TN5-20 detecteert Tau in een abnormale conformatie terwijl desandwich ELISA met het antilichaam TN5-20, voor zowel captatie als detectie, aggregaten van het Tau eiwit detecteert. Beide ELISAs gaven gelijkaardige resultaten bij analyse van de hersenen van de verschillende muizen op diverse leeftijden en met uiteenlopende klinische aandoeningen. Bovendien komen de ELISA gegevens overeen met de 68 kDa Tau isovorm in westernblot die kenmerkend is voor Tau pathologie en als kandidaat voor TauP* wordt beschouwd. Omdat er geen grote kwalitatieve verschillen in de fosforylatie van Tau werden gevonden in de voorhersenen en de hersenstam tussen pre-symptomatische, klinisch zieke en terminale Tau.P301L en biGTmuizen, blijven de exacte moleculaire oorzaken voor de vorming van TauP* nog onduidelijk. Verschillende posttranslationele modificaties van Tauwerden in acht genomen, met fosforylatie als meest beduidend. O-GluNac-ylatie van Tau werd in een parallel project al uitgesloten. In eerste instantie werd de algemene graad van fosforylatie geanalyseerd, die van belang is voor de initiatie van Tau pathologie. Later werden ook specifiekere combinaties van fosfo-epitopen geëvalueerd. Echter, met 45 serines, 35 threonines en 5 tyrosines aanwezig in de aminozuur sequentie van het Tau eiwit betekent dit een overvloed van mogelijke combinaties en van potentiële kinasen. Verder biochemisch onderzoek is nog bezig met o.a. nieuwe ontwikkelde antilichamen die specifiek zijn voor de conformatie en de fosforylatie van Tau.
Op basis van de gepostuleerdeamyloïd cascade hypothese werden therapeutische benaderingen voornamelijk gebaseerd op de amyloïd peptiden. Veel van deze benaderingen faalden echter in klinische studies omdat ze niet voldoende effectief waren of ernstige bijwerkingen vertoonden. Daardoor worden nu ook tal van andere behandelingsstrategieën ontwikkeld gebaseerd op andere pathologische doelwitten of gebeurtenissen. Deze worden onderzocht in preklinische studies in transgene muismodellen.
Het tweede deel van dit promotieonderzoek was gericht op de ontwikkeling, evaluatie en validatie van (i) actieve immunotherapy met op liposoom-gebaseerde vaccins die synthetische pathologische fosfo-Tau peptiden dragen en (ii) passieve immunotherapie met nieuwe ontwikkelde monoklonale antilichamen. Tau als doelwit, betekent dat niet enkel een behandeling van AD mogelijk wordt maar ook van de vele primaire Tau pathologieën. Zowel actieve als passieve immunotherapie bleek effectief in het verminderen van gefosforyleerd Tau in Tau.P301L en biGT muismodellen. Bovendien verminderde actieve immunotherapie in Tau.P301L muizen, althans gedeeltelijk, de vorming van grotere fibrillare aggregaten in de voorhersenen van deze muizen.
Naast de doeltreffendheid van de therapieën waren we ook uitermate geïnteresseerd in de veiligheid van beide strategieën, maar in het bijzonder van actieve vaccinatie. De liposomale vaccins bleken niet toxisch te zijn zelfs na herhaaldelijke toediening. Dit werd aangetoond door de verbeterde klinische conditie van de muizen, maar voornamelijk door de afwezigheid van neuro-inflammatie en door het feit dat de liposomale vaccins de ontwikkeling van antilichamen kunnen initiëren onafhankelijk van de activatie van T-cellen.
De gecombineerde resultaten van de experimentele actieve en passieve immunotherapieën in de LEGTEGG muismodellen voor tauopathie laten ons toe om voorzichtig optimistisch te zijn over hun potentieel voor de behandeling van primaire tauopathieën en de ziekte van AD, hetzij alleen, hetzij in combinatie met andere therapeutische benaderingen.
Datum:1 okt 2008 → 13 sep 2013
Trefwoorden:Post-translational modification, Therapy applications, Diagnostic applications, Transgenic mice, Tauopathy, Neurofibrillary tangles, Tau, Alzheimer's disease
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Systeembiologie, Neurowetenschappen, Biologische en fysiologische psychologie, Cognitieve wetenschappen en intelligente systemen, Ontwikkelingspsychologie en veroudering, Immunologie
Project type:PhD project