< Terug naar vorige pagina
Project
Prenatale Chromosomale Microarray Analyse en Identificatie van Genetische Variaties bij Congenitale Hernia Diafragmatica.
Chromosomale microarray analyse heeft de laatste jaren conventionele karyotypering geleidelijk aan vervangen als diagnostische test bij patiënten met ontwikkelingsstoornissen. Deze evolutie is het gevolg van de hogere resolutie van chromosomale microarray analyse waardoor kleinere oorzakelijke kopij variaties kunnen worden gedetecteerd. In deze thesis evalueerden we de voordelen evenals de verschillende uitdagingen betrokken bij de implementatie van chromosomale microarray analyse in de prenatale diagnostiek, vooral bij foetussen waar er een echografische afwijking werd gedetecteerd. Onze resultaten, beschreven in hoofdstuk 3, tonen bij 10% van de foetussen een pathogene kopij variatie (copy number variation of CNV). Hierbij wordt 3% veroorzaakt door submicroscopische CNVs die niet gedetecteerd zouden worden met conventionele karyotypering. Bovendienzorgde de hogere resolutie van chromosomale microarray analyse voor belangrijke extra informatie bij ~4% van de patiënten. Daarnaast werd ook een nieuw en onverwacht voordeel van arrays ontdekt: de identificatie vaneen paternele insertionele translocatie die naar alle waarschijnlijkheid de oorzaak was van een de novo ongebalanceerde translocatie bij het kind. De mogelijkheid om dergelijke fouten te identificeren bij ouders, laat toe het risico voor volgende zwangerschappen accurater in te schatten. Onze studie heeft gedeeltelijk de krijtlijnen uitgezet voor de recenteSummary Guidelines for Prenatal Chromosomal Microarray Analysis and Genetic Counselling van de Belgian Society for Human Genetics [http://www.beshg.be/download/annex_2_summary_of_array_and_prenatal_guidelines_20130502.pdf].
Congenitale hernia diafragmatica (CDH) is een levensbedreigende prenatale aandoening die gedetecteerd kan worden via echografie. Hoewel er reeds veel informatie over de ontstaansmechanismen van CDH gekend is door de studie van modelorganismen, blijft de kennis over de genetische basis van deze aandoening bij de mens fragmentarisch. Gezien men op basis van de genetische afwijking een prognose kan maken over het ontwikkelingspotentieel van de foetus, zou dergelijke kennis kunnen helpen bij het beslissingsproces over het al dan niet overgaan tot foetale therapie. Daarnaast zou een betere kennis van de pathogenese van CDH kunnen leiden tot een betere foetale therapie.
Ons doel was om de genetischefactoren die geïsoleerde CDH veroorzaken verder te ontrafelen. Hiervoorontwikkelden we een microarray die toeliet om kopij variaties te identificeren in loci en kandidaatgenen die eerder geïdentificeerd werden via klinische studies en studies in modelorganismen. Met behulp van deze microarray voerden we een retrospectieve studie uit op 79 patiënten met geïsoleerde CDH, waarvan de resultaten zijn weergegeven in hoofdstuk 4. In deze studie rapporteren we een mannelijke patiënt met een duplicatie in EFNB1 als mogelijk nieuwe genetische oorzaak van CDH. Na onze publicatiewerd ook in een tweede mannelijke patiënt een duplicatie van het EFNB1 gen vastgesteld, wat de evidentie versterkt dat gevoeligheid voor duplicaties en deleties van EFNB1 een oorzaak is van geïsoleerde CDH. Om vervolgens meer CNVs en genen betrokken bij CDH te identificeren startten weook een prospectieve prenatale studie in 75 foetussen met geïsoleerde CDH. De resultaten van deze studie, waarvoor we eveneens genoomwijde chromosomale microarrays gebruikten, worden ook beschreven in hoofdstuk 4. Deze studie ontdekte de novo submicroscopische pathogene CNVs in 9.3% van de foetussen en zeldzame, overgeërfde varianten die mogelijks betrokken zijn bij CDH in 4% van de foetussen. Foetussen met geïsoleerde CDH vormen dus een waardevolle groep voor CNV screening tijdens de prenatale fase. Ons onderzoek toont bovendien aan dat voor deze groep het nut van conventionele karyotypering beperkt is. Deze studie liet ook toe om de kritische gedeleteerde regio op 15q26 te verfijnen tot 2 genen, waarbij NR2F2 als het oorzakelijke gen wordt aangeduid. We brengen ook extra evidentie aan dat 15q25.2 en 16p11.2 recurrente microdeleties oorzakelijk zijnvoor CDH. We identificeerden bovendien nieuwe CNVs, waaronder een duplicatie van 4p15.2-p14, die nog niet eerder werden geassocieerd met CDH.
Vervolgens evalueerden we mogelijkheid om de oorzaak van geïsoleerde en niet-geïsoleerde CDH te bepalen via exonische sequentiebepaling. Onzeresultaten tonen aan dat exon sequencing een efficiënte techniek is om familiale CDH te onderzoeken, zoals beschreven in hoofdstuk 5. In een eerste familie werd een nonsense mutatie in ZFPM2 gedetecteerd in 2 foetussen met geïsoleerde CDH, en in hun broer met een aangeboren hartafwijking. De mutatie werd onverwacht doorgegeven via de niet aangetaste moeder,en komt ook voor bij de maternele grootvader en de maternele tante die beiden asymptomatisch zijn. Deze resultaten wijzen op variabele penetrantie van de mutatie en tonen de moeilijkheid aan om mutaties oorzakelijk voor CDH te identificeren. In een tweede familie met 2 mannelijke foetussen met multipele afwijkingen werd een mutatie in het X-gebonden PORCN gen geïdentificeerd. De mutatie werd overgeërfd van de asymptomatische moeder waarbij skewed X-inactivatie werd vastgesteld. Gezien PORCN betrokken is in het intracellulaire transport van Wnt proteinen, wijst deze bevinding op een belangrijke rol van de Wnt signaaltransductieweg in verschillende aspecten van foetale ontwikkeling en CDH. In een derde, consanguine familie werd een homozygote mutatie gedetecteerd in PIGN in een foetus met meerdere congenitale afwijkingen. Deze mutatie werd overgeërfd via elk van beide ouders. PIGN is betrokken in de synthese van GPI anchors wat strookt met de stijgende evidentie dat defecten in de synthese van GPI ankers verschillende fenotypes kunnen veroorzaken.
Aangeziende efficiëntie van de foetale en/of neonatale therapie bij CDH foetussen afhangt van de graad van de hernia en de pulmonaire hypoplasie zou hetidentificeren van biomerkers die gecorreleerd zijn met de ernst van deze aandoening de therapie kunnen sturen. Daarom besloten we te onderzoeken (i) of de genexpressie in amniosvocht van CDH foetussen een biomarker zou kunnen zijn voor de ernst van de aandoening en het effect van de behandeling.. In deze studie gebruikten we, zoals beschreven in hoofdstuk 6, RNA sequencing om de genexpressie in gekweekte amnioscellen van geïsoleerde CDH foetussen te onderzoeken. Onze analyse identificeerde 2 mogelijke moleculaire subtypes van geïsoleerde CDH, waarvan één gekarakteriseerd is door een verminderde transcriptie van TGFB1 en CTGF en een verhoogde transcriptie van TNF, IL-6 en IL-8. Dit duidt erop dat verminderde transcriptie van TGFB een mogelijke oorzaak is van de geobserveerde gestoorde regulatie van de verschillende doelwitgenen. Daarnaast toont deze groep van patiënten een inflammatoire respons door de verhoogde expressie van TNF, IL6 en IL8 wat postnatale pulmonaire hypertensie kan versterken. Deze resultaten vormen een goede start voor toekomstige studies die in een grotere groep geïsoleerde CDH patiënten zou moeten uitgevoerdworden om de klinische betekenis en het therapeutische potentieel te bepalen.
Congenitale hernia diafragmatica (CDH) is een levensbedreigende prenatale aandoening die gedetecteerd kan worden via echografie. Hoewel er reeds veel informatie over de ontstaansmechanismen van CDH gekend is door de studie van modelorganismen, blijft de kennis over de genetische basis van deze aandoening bij de mens fragmentarisch. Gezien men op basis van de genetische afwijking een prognose kan maken over het ontwikkelingspotentieel van de foetus, zou dergelijke kennis kunnen helpen bij het beslissingsproces over het al dan niet overgaan tot foetale therapie. Daarnaast zou een betere kennis van de pathogenese van CDH kunnen leiden tot een betere foetale therapie.
Ons doel was om de genetischefactoren die geïsoleerde CDH veroorzaken verder te ontrafelen. Hiervoorontwikkelden we een microarray die toeliet om kopij variaties te identificeren in loci en kandidaatgenen die eerder geïdentificeerd werden via klinische studies en studies in modelorganismen. Met behulp van deze microarray voerden we een retrospectieve studie uit op 79 patiënten met geïsoleerde CDH, waarvan de resultaten zijn weergegeven in hoofdstuk 4. In deze studie rapporteren we een mannelijke patiënt met een duplicatie in EFNB1 als mogelijk nieuwe genetische oorzaak van CDH. Na onze publicatiewerd ook in een tweede mannelijke patiënt een duplicatie van het EFNB1 gen vastgesteld, wat de evidentie versterkt dat gevoeligheid voor duplicaties en deleties van EFNB1 een oorzaak is van geïsoleerde CDH. Om vervolgens meer CNVs en genen betrokken bij CDH te identificeren startten weook een prospectieve prenatale studie in 75 foetussen met geïsoleerde CDH. De resultaten van deze studie, waarvoor we eveneens genoomwijde chromosomale microarrays gebruikten, worden ook beschreven in hoofdstuk 4. Deze studie ontdekte de novo submicroscopische pathogene CNVs in 9.3% van de foetussen en zeldzame, overgeërfde varianten die mogelijks betrokken zijn bij CDH in 4% van de foetussen. Foetussen met geïsoleerde CDH vormen dus een waardevolle groep voor CNV screening tijdens de prenatale fase. Ons onderzoek toont bovendien aan dat voor deze groep het nut van conventionele karyotypering beperkt is. Deze studie liet ook toe om de kritische gedeleteerde regio op 15q26 te verfijnen tot 2 genen, waarbij NR2F2 als het oorzakelijke gen wordt aangeduid. We brengen ook extra evidentie aan dat 15q25.2 en 16p11.2 recurrente microdeleties oorzakelijk zijnvoor CDH. We identificeerden bovendien nieuwe CNVs, waaronder een duplicatie van 4p15.2-p14, die nog niet eerder werden geassocieerd met CDH.
Vervolgens evalueerden we mogelijkheid om de oorzaak van geïsoleerde en niet-geïsoleerde CDH te bepalen via exonische sequentiebepaling. Onzeresultaten tonen aan dat exon sequencing een efficiënte techniek is om familiale CDH te onderzoeken, zoals beschreven in hoofdstuk 5. In een eerste familie werd een nonsense mutatie in ZFPM2 gedetecteerd in 2 foetussen met geïsoleerde CDH, en in hun broer met een aangeboren hartafwijking. De mutatie werd onverwacht doorgegeven via de niet aangetaste moeder,en komt ook voor bij de maternele grootvader en de maternele tante die beiden asymptomatisch zijn. Deze resultaten wijzen op variabele penetrantie van de mutatie en tonen de moeilijkheid aan om mutaties oorzakelijk voor CDH te identificeren. In een tweede familie met 2 mannelijke foetussen met multipele afwijkingen werd een mutatie in het X-gebonden PORCN gen geïdentificeerd. De mutatie werd overgeërfd van de asymptomatische moeder waarbij skewed X-inactivatie werd vastgesteld. Gezien PORCN betrokken is in het intracellulaire transport van Wnt proteinen, wijst deze bevinding op een belangrijke rol van de Wnt signaaltransductieweg in verschillende aspecten van foetale ontwikkeling en CDH. In een derde, consanguine familie werd een homozygote mutatie gedetecteerd in PIGN in een foetus met meerdere congenitale afwijkingen. Deze mutatie werd overgeërfd via elk van beide ouders. PIGN is betrokken in de synthese van GPI anchors wat strookt met de stijgende evidentie dat defecten in de synthese van GPI ankers verschillende fenotypes kunnen veroorzaken.
Aangeziende efficiëntie van de foetale en/of neonatale therapie bij CDH foetussen afhangt van de graad van de hernia en de pulmonaire hypoplasie zou hetidentificeren van biomerkers die gecorreleerd zijn met de ernst van deze aandoening de therapie kunnen sturen. Daarom besloten we te onderzoeken (i) of de genexpressie in amniosvocht van CDH foetussen een biomarker zou kunnen zijn voor de ernst van de aandoening en het effect van de behandeling.. In deze studie gebruikten we, zoals beschreven in hoofdstuk 6, RNA sequencing om de genexpressie in gekweekte amnioscellen van geïsoleerde CDH foetussen te onderzoeken. Onze analyse identificeerde 2 mogelijke moleculaire subtypes van geïsoleerde CDH, waarvan één gekarakteriseerd is door een verminderde transcriptie van TGFB1 en CTGF en een verhoogde transcriptie van TNF, IL-6 en IL-8. Dit duidt erop dat verminderde transcriptie van TGFB een mogelijke oorzaak is van de geobserveerde gestoorde regulatie van de verschillende doelwitgenen. Daarnaast toont deze groep van patiënten een inflammatoire respons door de verhoogde expressie van TNF, IL6 en IL8 wat postnatale pulmonaire hypertensie kan versterken. Deze resultaten vormen een goede start voor toekomstige studies die in een grotere groep geïsoleerde CDH patiënten zou moeten uitgevoerdworden om de klinische betekenis en het therapeutische potentieel te bepalen.
Datum:1 jun 2009 → 14 apr 2014
Trefwoorden:prenatal diagnosis, congenital diaphragmatic hernia, molecular karyotyping, array CGH
Disciplines:Genetica, Systeembiologie, Moleculaire en celbiologie
Project type:PhD project