< Terug naar vorige pagina
Project
Towards new therapeutic areas for HDL-targeted interventions
Plasmawaarden van hoge densiteit lipoproteïnen (HDL) cholesterol en zijn voornaamste apolipoproteïne (apo) A-I, zijn invers gecorreleerd met deincidentie van coronaire hartziekten. De Framingham Heart Study, de Kuopio Ischemic Heart Disease Factor Study, de Israel Ischemic Heart Disease Study en andere epidemiologische prospectieve cohortstudies hebben éénduidig aangetoond dat lagere HDL cholesterolspiegels een onafhankelijke risicofactor zijn voor ischemische hartziekten. Een meta-analyse van 4 prospectieve studies toonde aan dat een stijging van HDL cholesterolmet 1 mg/dl gepaard gaat met een vermindering van het risico op coronaire hartaandoeningen van 2% bij mannen en 3% bij vrouwen. Desalniettemin tonen deze epidemiologische studies geen oorzakelijk verband aan omdat residuele confounding hierin een rol kan spelen. Bewijs van een causaal verband vereist interventiestudies. Tot heden is de evaluatie van de hypothese dat een verhoging van HDL cholesterol de graad van atherosclerose en/of het optreden van ischemische coronaire incidenten verlaagt, belemmerd geweest door de afwezigheid van geneesmiddelen die HDL cholesterol selectief verhogen. Meerdere recente klinische interventiestudies die verschillende HDL verhogende strategieën hebben onderzocht (ILLUMINATE, ACCORD, dal-OUTCOMES, AIM-HIGH, HPS2-THRIVE), konden geen gunstige effectenaantonen op harde klinische eindpunten. Verder heeft een Mendeliaanse randomisatiestudie bij mensen aangetoond dat een genetische score gebaseerd op een combinatie van 14 polymorfismen geassocieerd met HDL cholesterol verhoging, niet gecorreleerd was met het risico op myocardinfarct.
Niettegenstaande een rijkdom aan informatie over deze intrigerende lipoproteïnen is bijgevolg nader onderzoek noodzakelijk om de HDL hypothese te toetsen. Men moet echter voor ogen houden dat het misschien nooit mogelijk zal zijn om de HDL hypothese te bewijzen of te weerleggen. Per slot, zoals reeds eerder vermeld, zijn selectief HDL verhogende geneesmiddelen immers niet beschikbaar voor klinisch gebruik. Bovendien kan de vooruitgang die geboekt wordt met nieuwe lipideverlagende therapieën, meer bepaald doel ik op lopend onderzoek van inhibitie van proproteïne convertase subtilisine/kexine type 9 in fase III klinische studies, mogelijkerwijze de context voor ontwikkeling van nieuwe lipidologische therapieën radicaal veranderen. Daarom is het aangewezen om nieuwe therapeutische gebieden voor HDL-gerichte interventies te bestuderen. De atheroprotectieve effecten van HDL worden vaak toegeschreven aan zijn rol in het proces van omgekeerd cholesterol transport. Nochtans beschikt HDL ook over andere functionele eigenschappen zoals anti-trombotische en endotheel-protectieve eigenschappen. HDL bevordert de overleving van endotheelcellen, stikstofmonoxideproductie (NO), migratie van endotheelcellen en het herstel van endotheel gemedieerd door endotheliale progenitorcellen (EPCs). Verder heeft HDL ook een anti-oxidatieve, anti-inflammatoire en anti-apoptotische werking. De acties van HDL reiken verder aangezien ze ook het metabolisme van glucose moduleren alsook immunologische responsen. Deze veelzijdigheid aan biologische acties van HDL is een stimulans om HDL-gerichte interventies te bestuderen in nieuwe therapeutische gebieden die buiten het klassieke veld van atherosclerose en vasculaire biologie liggen. Het coherent doel van deze doctoraatsthesis is het experimenteelaantonen van nieuw paradigmas aangaande effecten van HDL om zo een solide basis te leggen voor klinische translatie in strategisch uitgekozen therapeutische gebieden.
In een reeks van twee studies voorgesteld in dit manuscript, werd de ontwikkeling van een lokaal HDL-verhogende therapie bestudeerd in een muizenmodel van venegreffe atherosclerose en in een muizenmodel van cutane wondheling.
In hoofdstuk 3.1 werd de toediening van topische HDL op de adventitia van venegreffes bestudeerd als nieuwe therapeutische behandeling om doorgankelijkheid en functie van de venegreffe te verbeteren. De vena cava werd geïsoleerd uit donor C57BL/6 apo E deficiënte (apo E-/-) muizen en werd geënt tussen de uiteinden van rechter arteria carotis arteriën van 3 maand oude recipiënt C57BL/6 TIE2-LacZ/apo E-/- muizen. HDL (200 µg/ml; 50 µl) werd toegevoegd aan een 20% pluronische gel, die een biocompatibele en niet-toxische substantie is en gekarakteriseerd wordt door thermoreversibele gelvorming bij temperaturen hoger dan 21°C. Gebaseerd op de endotheel-protectieve eigenschappen en anti-inflammatoire effecten van HDL, postuleerden we dat topische HDL mogelijk de incorporatie van circulerende EPCs in het endotheel van de venegreffe zou verhogen, de endotheelregeneratie kan verbeteren en experimentele venegreffe atherosclerose zou inhiberen in apo E-/- muizen. Topische HDL behandeling verkleinde de intimale oppervlakte met 55% (p<0,001) op dag 28 in vergelijking met controlemuizen. Doorbloeding van greffes gemeten door micromagnetische resonantie beeldvorming op dag 28 was 2,8-voudig (p<0,0001) hoger in greffes behandeld met topische HDL in vergelijking met de onbehandelde greffes. Topische HDL behandeling resulteerde in een verminderde intimale inflammatie en in een verbeterde endotheliale regeneratie, hetgeen bleek uit een 1,9-voudige (p<0,05) verhoging in het aantal CD31-positieve endotheelcellen. HDL bracht een uitgesproken verbetering teweeg in de migratie- en adhesiecapaciteit van endotheel kolonievormende cellen (ECFCs) in vitro, en deze effecten bleken afhankelijk van signaaltransductie via scavenger receptor-BI (SR-BI), extracellulair signaal-gereguleerde kinasen, NO en van verhoogde ß1 integrine expressie. In overeenstemming hiermee, was het aantalCD31 ß-galactosidase dubbel positieve cellen, wat het aantal geïncorporeerde circulerende progenitorcellen weerspiegelt, 3,9-voudig (p<0,01) hoger in topisch HDL behandelde greffes in vergelijking met de onbehandelde greffes. Het effect van lokale HDL-verhogende therapie op venegreffe atherosclerose was even uitgesproken als bij het effect van systemisch HDL verhogende therapie geïnduceerd door humaan apo A-I gentransfer op venegreffe atherosclerose. Samengevat, topische HDL toediening op de adventitia van venegreffes verbetert doorgankelijkheid en functie van de venegreffe via een verhoogde incorporatie van circulerende progenitorcellen in het endotheel, bevordert endotheelregeneratie en vermindert inflammatie in de intima.
In hoofdstuk 3.2 werd dezelfde technologie, met name topische HDL toediening, gebruikt om cutane wondheling te bevorderen. Wondheling is een gevolg van complexe interacties tussen extracellulaire matrix moleculen, oplosbare mediatoren, residente huidcellen en infiltrerende leukocyten evenals infiltrerende EPCs. Eerder artificieel, kan wondheling onderverdeeld worden in een ontstekingsfase, een fase van weefselvorming met accumulatie van granulatieweefsel en re-epithelialisatie, en tenslotte een fase van weefselombouw. Diabetes is een risicofactor voor chronische, niet-helende wonden. Verscheidene factoren dragen bij tot een gebrekkige wondheling: onvoldoende groeifactorproductie, gebrekkige neovascularisatie, vertraagde keratinocyt- en fibroblastproliferatie en -migratie, en een gewijzigd evenwicht tussen extracellulaire matrix accumulatie en ombouw van de extracellulaire matrix door matrix metalloproteïnasen. Of dyslipidemie in diabetespatiënten bijdraagt tot eenvertraagde wondheling is tot nog toe niet geweten. Het doel van dit project was na te gaan of hypercholesterolemie in C57BL/6 apo E-/- muizen bijdraagt aan een slechte wondgenezing en of topische HDL behandeling wondheling versnelt in hypercholesterolemische C57BL/6 apo E-/- muizen en in C57BL/6 muizen met streptozotocine-geïnduceerde diabetes. Eerst hebbenwe een vergelijking gemaakt tussen normocholesterolemische C57BL/6 muizen en dyslipidemische C57BL/6 apo E-/- muizen. Wondbedekking met nieuwgevormd epitheelweefsel was 1,89-voudig (p<0,0001), 1,75-voudig (p<0,05), 1,47-voudig (p<0,001), 1,47-voudig (p<0,001) en 1,18-voudig (p<0,01) hoger in C57BL/6 muizen in vergelijking met C57BL/6 apo E-/- muizen op dag 2, dag 4, dag 6, dag 8 and dag 10 na verwonding, respectievelijk. Lokaletoediening van HDL (HDL proteïneconcentratie 400 µg/ml) geformuleerd in een 20% pluronische F-127 gel (pH 7,2) verhoogde re-epithelialisatie met een 1,35-voudig (p<0,05), 1,44-voudig (p<0,05) en 1,21-voudig (p<0,01) verschil op respectievelijk dag 6, dag 8 en dag 10. De snelheid van re-epithelialisatie was niet significant verschillend tussen onbehandelde controlewonden en controlewonden behandeld met pluronische F-127 gel(pH 7,2). Wondheling was vertraagd in C57BL/6 muizen met streptozotocin-geïnduceerde diabetes in vergelijking met de niet-diabetische nestgenoten. In C57BL/6 muizen met streptozotocine-geïnduceerde diabetes was wondbedekking met nieuw epitheel na topische HDL behandeling een 1,93-voudig(p<0,01), 1,22-voudig (p=NS), 1,37-voudig (p<0,01) en 1,11-voudig (p=NS) verhoogd op respectievelijk dag 4, dag 6, dag 8 en dag 10 na verwonding. In de verschillende experimentele condities correleerde wondbedekkingmet granulatieweefsel met de graad van re-epithelialisatie. Samenvattend, deze studie toont aan dat topische HDL applicatie in dyslipidemische muizen en in diabetische muizen de snelheid van wondgenezing terug tot op het niveau brengt van wondheling in normocholesterolemische, niet-diabetische muizen en op basis van deze resultaten kan men stellen dat de eerste fundamenten voor een nieuw behandelingsparadigma voor cutane ulcera, met name topische HDL therapie, gelegd zijn.
De volgende twee studies van dit doctoraat beoogden de effecten van een systemisch HDL verhogende therapie, geïnduceerd door apo A-I gentransfer, op structuur en functie van het hart in af- of aanwezigheid van een hartinfarct te bestuderen. Hypercholesterolemie en lage plasmawaarden van HDL cholesterol zijn risicofactoren voor coronaire hartziekten maar anderzijds is het nietgeweten of er rechtstreekse effecten zijn van lipoproteïnen op het hart. In patiënten met lage HDL cholesterol plasmawaarden is de ejectiefractie na myocardinfarct (MI) gedaald. In deelnemers van de Framingham HeartStudy, die vrij waren van coronaire hartziekten bij aanvang van de studie, was een lage HDL cholesterolspiegel onafhankelijk geassocieerd met de incidentie van hartfalen en deze associatie bleef standhouden na correctie voor interim MI en klinische covariabelen. Bovendien zijn lage HDL cholesterol spiegels en lage apo A-I spiegels indicatief voor een ongunstige prognose in patiënten met hartfalen onafhankelijk van de etiologie van hartfalen. Rechtstreekse cellulaire effecten van HDL zijn aangetoondin geïsoleerde cardiomyocyten in vitro zoals blijkt uit een verhoogde fosforylatie van extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen, van de transcriptie factor STAT3 en het pro-overlevingskinase Akt. Verder werd hetreeds eerder aangetoond dat HDL apoptose van cardiomyocyten inhibeert onder condities van hyperglycemie. Tenslotte werd de ontwikkeling van diabetische cardiomyopathie geïnhibeerd door humaan apo A-I gentransfer in ratten. Samengevat, zowel epidemiologische als experimentele studies onderbouwen de hypothese dat HDL mogelijk rechtstreeks effecten uitoefent op het myocard.
In hoofdstuk 3.3 onderzochten we het effect van lipideverlagende gentransfer en selectief HDL-verhogende gentransfer op EPC aantal en EPC functie en op de structuur en functie van het hart in hypercholesterolemische C57BL/6 lage densiteit lipoproteïne receptor deficiënte (LDLr-/-) muizen onderzocht. Lipideverlagende en HDL verhogende gentransfer werd uitgevoerd door middel van E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vectoren die de LDLr tot expressie brengen (AdLDLr) en E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vectoren die humaan apo A-I tot expressie brengen (AdA-I), respectievelijk. AdLDLr transfer in C57BL/6 LDLr-/- muizen resulteerde in een 2,0-voudig (p<0,05) verhoging in het aantal circulerende EPCs en in een verbeterde EPC functie geëvalueerd door ex vivo EPC migratieen EPC adhesie experimenten. De capillaire densiteit en relatieve vasculariteit in het myocardium was 28% (p<0,01) en 22% (p<0,05) hoger, respectievelijk, in AdLDLr muizen in vergelijking met de controlemuizen. De pieksnelheid van isovolumetrische relaxatie was verhoogd met 12% (p<0,05)en de tijdsconstante van isovolumetrische relaxatie was gedaald met 14%(p<0,05) na AdLDLr transfer. Op gelijkaardige wijze verhoogde AdA-I transfer EPC aantal en functie en verhoogde zowel de capillaire densiteit alsook de relatieve vasculariteit in het hart met 24% (p<0,05). De pieksnelheid van isovolumetrische relaxatie was verhoogd met 16% (p<0,05) in AdA-I muizen in vergelijking met controlemuizen. In conclusie, zowel lipideverlagende als HDL verhogende gentransfer heeft gunstige effecten op EPC biologie, relatieve vasculariteit van het hart en diastolische functie. Deze bevindingen geven aanleiding tot bezorgdheid over de externe validiteit van studies die de biologie van het hart en het herstel van het hart in normocholesterolemische dierenmodellen onderzoeken die vaak gekarakteriseerd worden door een predominantie van HDL.
In hoofdstuk 3.4 hebben we onderzocht wat de effecten zijn van selectief HDL-verhogende gentransfer in een muizenmodel van ischemische cardiomyopathie. Meer specifiek was de doelstelling van deze studie na te gaan of humaan apo A-I gentransfer in hypercholesterolemische C57BL/6 LDLr-/- muizen overleving, infarctgrootte en hartfunctie gunstig beïnvloedt na permanente ligatie van de afdalende tak van de linker kransslagader. Om de rechtstreekse effecten van HDL op myocardbiologie te bestuderen werd gekozen voor een model van permanente ligatie en niet voor een model van ischemie/reperfusieschade. Gentransfer in C57BL/6 LDLr-/- muizen werd uitgevoerd met de E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vector AdA-I die humaan apo A-I specifiek in hepatocyten tot expressie brengt of met de controlevector Adnull.Het hartinfarct werd geïnduceerd door permanente afbinding van de dalende tak van de linker kransslagader 2 weken na gentransfer of na injectievan een zoutoplossing. HDL cholesterol was 1,5-voudig (p<0,0001) verhoogd in de AdA-I muizen in vergelijking met de controlemuizen. Overleving was verhoogd (p<0,01) in AdA-I muizen in vergelijking met controlemuizengedurende de 28 dagen opvolging na MI (risico ratio voor mortaliteit 0,42; 95% betrouwbaarheidsinterval 0,24 tot 0,76). Een longitudinale morfometrische analyse toonde een verminderde infarctexpansie en dilatatie van het linkerventrikel aan in AdA-I behandelde muizen in vergelijking metde controlemuizen. AdA-I transfer bewerkstelligde immunomodulatorische effecten en verhoogde neovascularisatie in het infarctgebied. Verhoogde HDL na AdA-I transfer verbeterde significant de systolische en diastolische hartfunctie na MI en resulteerde in behoud van de perifere bloeddruk. Samengevat, selectief HDL verhogende gentransfer resulteert in cardioprotectieve effecten na hartinfarct.
Tot besluit, de resultaten van deze doctoraatsthesis vormen een solide basis voor preklinische ontwikkeling van toekomstige therapeutische modaliteiten voor HDL-gerichte interventies. Topische HDL therapie vormt mogelijk een toekomstige innovatieve en klinisch haalbare therapeutische strategie voor heling van diabetische ulcera. Klinische translatie van apo A-I gentransfer als middel omHDL spiegels te verhogen zal afhankelijk zijn van de verdere ontwikkeling van krachtige en veilige gentransfervectoren en van de vorderingen gemaakt in het veld van adeno-geassocieerde virale gentherapie.
Niettegenstaande een rijkdom aan informatie over deze intrigerende lipoproteïnen is bijgevolg nader onderzoek noodzakelijk om de HDL hypothese te toetsen. Men moet echter voor ogen houden dat het misschien nooit mogelijk zal zijn om de HDL hypothese te bewijzen of te weerleggen. Per slot, zoals reeds eerder vermeld, zijn selectief HDL verhogende geneesmiddelen immers niet beschikbaar voor klinisch gebruik. Bovendien kan de vooruitgang die geboekt wordt met nieuwe lipideverlagende therapieën, meer bepaald doel ik op lopend onderzoek van inhibitie van proproteïne convertase subtilisine/kexine type 9 in fase III klinische studies, mogelijkerwijze de context voor ontwikkeling van nieuwe lipidologische therapieën radicaal veranderen. Daarom is het aangewezen om nieuwe therapeutische gebieden voor HDL-gerichte interventies te bestuderen. De atheroprotectieve effecten van HDL worden vaak toegeschreven aan zijn rol in het proces van omgekeerd cholesterol transport. Nochtans beschikt HDL ook over andere functionele eigenschappen zoals anti-trombotische en endotheel-protectieve eigenschappen. HDL bevordert de overleving van endotheelcellen, stikstofmonoxideproductie (NO), migratie van endotheelcellen en het herstel van endotheel gemedieerd door endotheliale progenitorcellen (EPCs). Verder heeft HDL ook een anti-oxidatieve, anti-inflammatoire en anti-apoptotische werking. De acties van HDL reiken verder aangezien ze ook het metabolisme van glucose moduleren alsook immunologische responsen. Deze veelzijdigheid aan biologische acties van HDL is een stimulans om HDL-gerichte interventies te bestuderen in nieuwe therapeutische gebieden die buiten het klassieke veld van atherosclerose en vasculaire biologie liggen. Het coherent doel van deze doctoraatsthesis is het experimenteelaantonen van nieuw paradigmas aangaande effecten van HDL om zo een solide basis te leggen voor klinische translatie in strategisch uitgekozen therapeutische gebieden.
In een reeks van twee studies voorgesteld in dit manuscript, werd de ontwikkeling van een lokaal HDL-verhogende therapie bestudeerd in een muizenmodel van venegreffe atherosclerose en in een muizenmodel van cutane wondheling.
In hoofdstuk 3.1 werd de toediening van topische HDL op de adventitia van venegreffes bestudeerd als nieuwe therapeutische behandeling om doorgankelijkheid en functie van de venegreffe te verbeteren. De vena cava werd geïsoleerd uit donor C57BL/6 apo E deficiënte (apo E-/-) muizen en werd geënt tussen de uiteinden van rechter arteria carotis arteriën van 3 maand oude recipiënt C57BL/6 TIE2-LacZ/apo E-/- muizen. HDL (200 µg/ml; 50 µl) werd toegevoegd aan een 20% pluronische gel, die een biocompatibele en niet-toxische substantie is en gekarakteriseerd wordt door thermoreversibele gelvorming bij temperaturen hoger dan 21°C. Gebaseerd op de endotheel-protectieve eigenschappen en anti-inflammatoire effecten van HDL, postuleerden we dat topische HDL mogelijk de incorporatie van circulerende EPCs in het endotheel van de venegreffe zou verhogen, de endotheelregeneratie kan verbeteren en experimentele venegreffe atherosclerose zou inhiberen in apo E-/- muizen. Topische HDL behandeling verkleinde de intimale oppervlakte met 55% (p<0,001) op dag 28 in vergelijking met controlemuizen. Doorbloeding van greffes gemeten door micromagnetische resonantie beeldvorming op dag 28 was 2,8-voudig (p<0,0001) hoger in greffes behandeld met topische HDL in vergelijking met de onbehandelde greffes. Topische HDL behandeling resulteerde in een verminderde intimale inflammatie en in een verbeterde endotheliale regeneratie, hetgeen bleek uit een 1,9-voudige (p<0,05) verhoging in het aantal CD31-positieve endotheelcellen. HDL bracht een uitgesproken verbetering teweeg in de migratie- en adhesiecapaciteit van endotheel kolonievormende cellen (ECFCs) in vitro, en deze effecten bleken afhankelijk van signaaltransductie via scavenger receptor-BI (SR-BI), extracellulair signaal-gereguleerde kinasen, NO en van verhoogde ß1 integrine expressie. In overeenstemming hiermee, was het aantalCD31 ß-galactosidase dubbel positieve cellen, wat het aantal geïncorporeerde circulerende progenitorcellen weerspiegelt, 3,9-voudig (p<0,01) hoger in topisch HDL behandelde greffes in vergelijking met de onbehandelde greffes. Het effect van lokale HDL-verhogende therapie op venegreffe atherosclerose was even uitgesproken als bij het effect van systemisch HDL verhogende therapie geïnduceerd door humaan apo A-I gentransfer op venegreffe atherosclerose. Samengevat, topische HDL toediening op de adventitia van venegreffes verbetert doorgankelijkheid en functie van de venegreffe via een verhoogde incorporatie van circulerende progenitorcellen in het endotheel, bevordert endotheelregeneratie en vermindert inflammatie in de intima.
In hoofdstuk 3.2 werd dezelfde technologie, met name topische HDL toediening, gebruikt om cutane wondheling te bevorderen. Wondheling is een gevolg van complexe interacties tussen extracellulaire matrix moleculen, oplosbare mediatoren, residente huidcellen en infiltrerende leukocyten evenals infiltrerende EPCs. Eerder artificieel, kan wondheling onderverdeeld worden in een ontstekingsfase, een fase van weefselvorming met accumulatie van granulatieweefsel en re-epithelialisatie, en tenslotte een fase van weefselombouw. Diabetes is een risicofactor voor chronische, niet-helende wonden. Verscheidene factoren dragen bij tot een gebrekkige wondheling: onvoldoende groeifactorproductie, gebrekkige neovascularisatie, vertraagde keratinocyt- en fibroblastproliferatie en -migratie, en een gewijzigd evenwicht tussen extracellulaire matrix accumulatie en ombouw van de extracellulaire matrix door matrix metalloproteïnasen. Of dyslipidemie in diabetespatiënten bijdraagt tot eenvertraagde wondheling is tot nog toe niet geweten. Het doel van dit project was na te gaan of hypercholesterolemie in C57BL/6 apo E-/- muizen bijdraagt aan een slechte wondgenezing en of topische HDL behandeling wondheling versnelt in hypercholesterolemische C57BL/6 apo E-/- muizen en in C57BL/6 muizen met streptozotocine-geïnduceerde diabetes. Eerst hebbenwe een vergelijking gemaakt tussen normocholesterolemische C57BL/6 muizen en dyslipidemische C57BL/6 apo E-/- muizen. Wondbedekking met nieuwgevormd epitheelweefsel was 1,89-voudig (p<0,0001), 1,75-voudig (p<0,05), 1,47-voudig (p<0,001), 1,47-voudig (p<0,001) en 1,18-voudig (p<0,01) hoger in C57BL/6 muizen in vergelijking met C57BL/6 apo E-/- muizen op dag 2, dag 4, dag 6, dag 8 and dag 10 na verwonding, respectievelijk. Lokaletoediening van HDL (HDL proteïneconcentratie 400 µg/ml) geformuleerd in een 20% pluronische F-127 gel (pH 7,2) verhoogde re-epithelialisatie met een 1,35-voudig (p<0,05), 1,44-voudig (p<0,05) en 1,21-voudig (p<0,01) verschil op respectievelijk dag 6, dag 8 en dag 10. De snelheid van re-epithelialisatie was niet significant verschillend tussen onbehandelde controlewonden en controlewonden behandeld met pluronische F-127 gel(pH 7,2). Wondheling was vertraagd in C57BL/6 muizen met streptozotocin-geïnduceerde diabetes in vergelijking met de niet-diabetische nestgenoten. In C57BL/6 muizen met streptozotocine-geïnduceerde diabetes was wondbedekking met nieuw epitheel na topische HDL behandeling een 1,93-voudig(p<0,01), 1,22-voudig (p=NS), 1,37-voudig (p<0,01) en 1,11-voudig (p=NS) verhoogd op respectievelijk dag 4, dag 6, dag 8 en dag 10 na verwonding. In de verschillende experimentele condities correleerde wondbedekkingmet granulatieweefsel met de graad van re-epithelialisatie. Samenvattend, deze studie toont aan dat topische HDL applicatie in dyslipidemische muizen en in diabetische muizen de snelheid van wondgenezing terug tot op het niveau brengt van wondheling in normocholesterolemische, niet-diabetische muizen en op basis van deze resultaten kan men stellen dat de eerste fundamenten voor een nieuw behandelingsparadigma voor cutane ulcera, met name topische HDL therapie, gelegd zijn.
De volgende twee studies van dit doctoraat beoogden de effecten van een systemisch HDL verhogende therapie, geïnduceerd door apo A-I gentransfer, op structuur en functie van het hart in af- of aanwezigheid van een hartinfarct te bestuderen. Hypercholesterolemie en lage plasmawaarden van HDL cholesterol zijn risicofactoren voor coronaire hartziekten maar anderzijds is het nietgeweten of er rechtstreekse effecten zijn van lipoproteïnen op het hart. In patiënten met lage HDL cholesterol plasmawaarden is de ejectiefractie na myocardinfarct (MI) gedaald. In deelnemers van de Framingham HeartStudy, die vrij waren van coronaire hartziekten bij aanvang van de studie, was een lage HDL cholesterolspiegel onafhankelijk geassocieerd met de incidentie van hartfalen en deze associatie bleef standhouden na correctie voor interim MI en klinische covariabelen. Bovendien zijn lage HDL cholesterol spiegels en lage apo A-I spiegels indicatief voor een ongunstige prognose in patiënten met hartfalen onafhankelijk van de etiologie van hartfalen. Rechtstreekse cellulaire effecten van HDL zijn aangetoondin geïsoleerde cardiomyocyten in vitro zoals blijkt uit een verhoogde fosforylatie van extracellulaire signaal-gereguleerde kinasen, van de transcriptie factor STAT3 en het pro-overlevingskinase Akt. Verder werd hetreeds eerder aangetoond dat HDL apoptose van cardiomyocyten inhibeert onder condities van hyperglycemie. Tenslotte werd de ontwikkeling van diabetische cardiomyopathie geïnhibeerd door humaan apo A-I gentransfer in ratten. Samengevat, zowel epidemiologische als experimentele studies onderbouwen de hypothese dat HDL mogelijk rechtstreeks effecten uitoefent op het myocard.
In hoofdstuk 3.3 onderzochten we het effect van lipideverlagende gentransfer en selectief HDL-verhogende gentransfer op EPC aantal en EPC functie en op de structuur en functie van het hart in hypercholesterolemische C57BL/6 lage densiteit lipoproteïne receptor deficiënte (LDLr-/-) muizen onderzocht. Lipideverlagende en HDL verhogende gentransfer werd uitgevoerd door middel van E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vectoren die de LDLr tot expressie brengen (AdLDLr) en E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vectoren die humaan apo A-I tot expressie brengen (AdA-I), respectievelijk. AdLDLr transfer in C57BL/6 LDLr-/- muizen resulteerde in een 2,0-voudig (p<0,05) verhoging in het aantal circulerende EPCs en in een verbeterde EPC functie geëvalueerd door ex vivo EPC migratieen EPC adhesie experimenten. De capillaire densiteit en relatieve vasculariteit in het myocardium was 28% (p<0,01) en 22% (p<0,05) hoger, respectievelijk, in AdLDLr muizen in vergelijking met de controlemuizen. De pieksnelheid van isovolumetrische relaxatie was verhoogd met 12% (p<0,05)en de tijdsconstante van isovolumetrische relaxatie was gedaald met 14%(p<0,05) na AdLDLr transfer. Op gelijkaardige wijze verhoogde AdA-I transfer EPC aantal en functie en verhoogde zowel de capillaire densiteit alsook de relatieve vasculariteit in het hart met 24% (p<0,05). De pieksnelheid van isovolumetrische relaxatie was verhoogd met 16% (p<0,05) in AdA-I muizen in vergelijking met controlemuizen. In conclusie, zowel lipideverlagende als HDL verhogende gentransfer heeft gunstige effecten op EPC biologie, relatieve vasculariteit van het hart en diastolische functie. Deze bevindingen geven aanleiding tot bezorgdheid over de externe validiteit van studies die de biologie van het hart en het herstel van het hart in normocholesterolemische dierenmodellen onderzoeken die vaak gekarakteriseerd worden door een predominantie van HDL.
In hoofdstuk 3.4 hebben we onderzocht wat de effecten zijn van selectief HDL-verhogende gentransfer in een muizenmodel van ischemische cardiomyopathie. Meer specifiek was de doelstelling van deze studie na te gaan of humaan apo A-I gentransfer in hypercholesterolemische C57BL/6 LDLr-/- muizen overleving, infarctgrootte en hartfunctie gunstig beïnvloedt na permanente ligatie van de afdalende tak van de linker kransslagader. Om de rechtstreekse effecten van HDL op myocardbiologie te bestuderen werd gekozen voor een model van permanente ligatie en niet voor een model van ischemie/reperfusieschade. Gentransfer in C57BL/6 LDLr-/- muizen werd uitgevoerd met de E1E3E4-gedeleteerde adenovirale vector AdA-I die humaan apo A-I specifiek in hepatocyten tot expressie brengt of met de controlevector Adnull.Het hartinfarct werd geïnduceerd door permanente afbinding van de dalende tak van de linker kransslagader 2 weken na gentransfer of na injectievan een zoutoplossing. HDL cholesterol was 1,5-voudig (p<0,0001) verhoogd in de AdA-I muizen in vergelijking met de controlemuizen. Overleving was verhoogd (p<0,01) in AdA-I muizen in vergelijking met controlemuizengedurende de 28 dagen opvolging na MI (risico ratio voor mortaliteit 0,42; 95% betrouwbaarheidsinterval 0,24 tot 0,76). Een longitudinale morfometrische analyse toonde een verminderde infarctexpansie en dilatatie van het linkerventrikel aan in AdA-I behandelde muizen in vergelijking metde controlemuizen. AdA-I transfer bewerkstelligde immunomodulatorische effecten en verhoogde neovascularisatie in het infarctgebied. Verhoogde HDL na AdA-I transfer verbeterde significant de systolische en diastolische hartfunctie na MI en resulteerde in behoud van de perifere bloeddruk. Samengevat, selectief HDL verhogende gentransfer resulteert in cardioprotectieve effecten na hartinfarct.
Tot besluit, de resultaten van deze doctoraatsthesis vormen een solide basis voor preklinische ontwikkeling van toekomstige therapeutische modaliteiten voor HDL-gerichte interventies. Topische HDL therapie vormt mogelijk een toekomstige innovatieve en klinisch haalbare therapeutische strategie voor heling van diabetische ulcera. Klinische translatie van apo A-I gentransfer als middel omHDL spiegels te verhogen zal afhankelijk zijn van de verdere ontwikkeling van krachtige en veilige gentransfervectoren en van de vorderingen gemaakt in het veld van adeno-geassocieerde virale gentherapie.
Datum:1 okt 2009 → 30 sep 2013
Trefwoorden:Tissue repair, HDL therapy
Disciplines:Cardiale en vasculaire geneeskunde
Project type:PhD project