< Terug naar vorige pagina
Project
In vivo evaluatie van de simultane inhibitie van TAFI en PAI-1: op weg naar een effectieve en veilige trombolyse
Trombine-activeerbare fibrinolyse inhibitor (TAFI) en plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1) zijn belangrijke mediatoren van het fibrinolytisch systeem. Hoewel dit gebeurt via verschillende werkingsmechanismen, vertragen beide eiwitten de weefsel-type plasminogeen activator (tPA)-gemedieerde omzetting van plasminogeen tot het fibrine oplossend enzyme, plasmine. Geactiveerd TAFI (TAFIa) verwijdert C-terminale lysines van hetfibrine oppervlak met een verhoogde resistentie tegen fibrinolyse tot gevolg. PAI-1 neutraliseert tPA door de vorming van een covalent complex en wordt beschouwd als de voornaamste inhibitor van tPA. Verhoogde TAFI-en/of PAI-1-waarden worden dan ook geassocieerd met diverse cardiovasculaire aandoeningen zoals coronaire vaatziekten, veneuze trombose en cerebrovasculaire accidenten (CVA).
De enige medicijnen die momenteel beschikbaar zijn om trombolyse uit te voeren, bestaan uit plasminogeen activatoren. Plasminogeen activatoren blijven echter onderbenut omwille van ernstige nadelen, zoals een beperkt rekanaliserend effect, een hoog bloedingsrisico en het mogelijk optreden van neurotoxiciteit. Gezien de klinische behoefte aan nieuwe trombolytische agentia werd in deze studie een nieuwe trombolytische strategie geëvalueerd die gericht is op hetstimuleren van de endogene fibrinolyse via de simultane inhibitie van TAFI en PAI-1. In een vorige studie werd voor de eerste keer een heterodimeer diabody gegenereerd tegen humaan TAFI en humaan PAI-1 dat een sterke profibrinolytische capaciteit vertoonde in het lyseren van experimentele humane trombi. Een heterodimeer diabody is een recombinant antilichaam derivaat met een duale specificiteit en werd in deze studie gebruikt om complicaties geassocieerd met de toediening van twee verschillende inhibitoren te omzeilen. In de huidige studie werden in vivo toepassingen van de duale TAFI/PAI-1 inhibitie door middel van een diabody geëvalueerd.
In hoofdstuk 2 werd een recombinant bispecifiek diabody gegenereerd uit MA-RT36A3F5 gericht tegen rat TAFI (dat enkel cross-reageert met murien TAFI) en MA-33H1F7 tegen humaan PAI-1 (dat cross-reageertmet murien en rat PAI-1). MA-RT36A3F5 interfereert met TAFI door TAFIa te destabiliseren. MA-33H1F7 zet actief PAI-1 om tot een substraat voor tPA, hetgeen resulteert in de inactivatie van PAI-1. Hoewel het diabody met succes tot expressie werd gebracht in bacteriën en de inhiberende eigenschappen van de parentale antilichamen behouden bleven, was het profibrinolytisch effect echter van transiënte aard vanwege een lage stabiliteit in plasma. Door antilichaam engineering toe te passen (door middel van CDR-graften en linker additie) werd een gestabiliseerde vorm van dit diabody bekomen met een vergelijkbare profibrinolytische capaciteit als die van de parentale antilichamen.
In hoofdstuk 3 werd een tweede diabody gegenereerd uit MA-TCK26D6, gericht tegen een stabiele variant van humaan TAFI, en MA-33H1F7. MA-TCK26D6 is het eerste antilichaam dat cross-reageert met zowel humaan, murien als ratTAFI. Een belangrijk voordeel van het overeenkomstige diabody, Db-TCK26D6x33H1F7, is dat het kan worden uitgetest in zowel preklinische als klinische studies. De functionele eigenschappen van de parentale antilichamen werden door het diabody overgedragen en bovendien bleef de stabiliteit van het diabody inplasma bewaard. Dit resulteerde in een in vitro profibrinolytisch effect dat zelfs het effect van de combinatie van de parentale antilichamen overtrof. Bovendien interfereerde het diabody niet met de gunstige anti-inflammatoire eigenschappen van TAFIa. Om die redenen werd het diabody, Db-TCK26D6x33H1F7, geselecteerd voor de verdere evaluatie in vivo.
In hoofdstuk 4 werden de profibrinolytische eigenschappen van de parentale antilichamen of het corresponderende diabody (Db-TCK26D6x33H1F7) eerst onderzocht in een muis model van trombo-embolie, geïnduceerd door systemische toediening van weefsel factor. Hoewel de toediening van antilichamen, afzonderlijk of gecombineerd, slechts een half-maximale fibrineklaring veroorzaakte in de longen, resulteerde een overeenkomstige dosis van het diabody in een maximaal effect. Daarna werd in een muis model van cerebrale ischemie/reperfusie het diabody vergeleken met de antilichamen. Terwijl hier de afzonderlijke toediening van antilichamen bij een bepaalde dosis geen effect veroorzaakte, resulteerde de toediening van beide antilichamen of het diabody in een gereduceerde reperfusie-gemedieerde schade met kleinere lesievolumes en een verbeterde neurologische en motorische functie tot gevolg. Bovendien was het diabody effectiever in het verbeteren van de neurologische en motorische functie dan de combinatie van antilichamen. De superieure profibrinolytische capaciteit vanhet diabody is waarschijnlijk te wijten aan zijn relatief kleine (58 kDa) en flexibele structuur.
In hoofdstuk 5 werd de trombolytische capaciteit van Db-TCK26D6x33H1F7 beoordeeld door het diabody toe te dienen na trombusvorming in twee verschillende trombose-geïnduceerde CVA modellen. Het effect van het diabody werd telkens vergeleken met dat van tPA, gebruikt in de huidige behandeling van AIS. In het trombine-geïnduceerd model worden fibrine-rijke klonters gevormd die gevoelig zijn voor tPA-gemedieerde fibrinolyse. Na behandeling met het diabody werden de lesievolumes aanzienlijk gereduceerd 24 uur na het induceren van stroke, terwijlde tPA behandeling slechts een matig effect had. In het FeCl(3)-geïnduceerd model worden bloedplaatjes-rijke klonters gevormd die resistent zijn tegen tPA-gemedieerde fibrinolyse. Terwijl tPA inderdaad geen effect had, was het diabody in staat om de arterie te rekanaliseren, de hersendoorbloeding te verbeteren en lesievolumes te reduceren. Bovendien veroorzaakte het diabody, in tegenstelling tot tPA, geen verlengde bloedingstijden.
Kortom, deze studie toont aan dat de simultane inhibitie van twee antifibrinolytische proteïnes, TAFI en PAI-1, een sterk profibrinolytisch effect teweeg brengt in vivo. De twee belangrijkste uitkomsten van deze studie zijn dat (i) de simultane inhibitie van TAFI en PAI-1 door middel van het diabody effectiever is dan door de combinatie vantwee antilichamen en (ii) het diabody potenter, maar tegelijkertijd ookpotentieel veiliger, is dan tPA voor het behandelen van experimentele CVA.
De enige medicijnen die momenteel beschikbaar zijn om trombolyse uit te voeren, bestaan uit plasminogeen activatoren. Plasminogeen activatoren blijven echter onderbenut omwille van ernstige nadelen, zoals een beperkt rekanaliserend effect, een hoog bloedingsrisico en het mogelijk optreden van neurotoxiciteit. Gezien de klinische behoefte aan nieuwe trombolytische agentia werd in deze studie een nieuwe trombolytische strategie geëvalueerd die gericht is op hetstimuleren van de endogene fibrinolyse via de simultane inhibitie van TAFI en PAI-1. In een vorige studie werd voor de eerste keer een heterodimeer diabody gegenereerd tegen humaan TAFI en humaan PAI-1 dat een sterke profibrinolytische capaciteit vertoonde in het lyseren van experimentele humane trombi. Een heterodimeer diabody is een recombinant antilichaam derivaat met een duale specificiteit en werd in deze studie gebruikt om complicaties geassocieerd met de toediening van twee verschillende inhibitoren te omzeilen. In de huidige studie werden in vivo toepassingen van de duale TAFI/PAI-1 inhibitie door middel van een diabody geëvalueerd.
In hoofdstuk 2 werd een recombinant bispecifiek diabody gegenereerd uit MA-RT36A3F5 gericht tegen rat TAFI (dat enkel cross-reageert met murien TAFI) en MA-33H1F7 tegen humaan PAI-1 (dat cross-reageertmet murien en rat PAI-1). MA-RT36A3F5 interfereert met TAFI door TAFIa te destabiliseren. MA-33H1F7 zet actief PAI-1 om tot een substraat voor tPA, hetgeen resulteert in de inactivatie van PAI-1. Hoewel het diabody met succes tot expressie werd gebracht in bacteriën en de inhiberende eigenschappen van de parentale antilichamen behouden bleven, was het profibrinolytisch effect echter van transiënte aard vanwege een lage stabiliteit in plasma. Door antilichaam engineering toe te passen (door middel van CDR-graften en linker additie) werd een gestabiliseerde vorm van dit diabody bekomen met een vergelijkbare profibrinolytische capaciteit als die van de parentale antilichamen.
In hoofdstuk 3 werd een tweede diabody gegenereerd uit MA-TCK26D6, gericht tegen een stabiele variant van humaan TAFI, en MA-33H1F7. MA-TCK26D6 is het eerste antilichaam dat cross-reageert met zowel humaan, murien als ratTAFI. Een belangrijk voordeel van het overeenkomstige diabody, Db-TCK26D6x33H1F7, is dat het kan worden uitgetest in zowel preklinische als klinische studies. De functionele eigenschappen van de parentale antilichamen werden door het diabody overgedragen en bovendien bleef de stabiliteit van het diabody inplasma bewaard. Dit resulteerde in een in vitro profibrinolytisch effect dat zelfs het effect van de combinatie van de parentale antilichamen overtrof. Bovendien interfereerde het diabody niet met de gunstige anti-inflammatoire eigenschappen van TAFIa. Om die redenen werd het diabody, Db-TCK26D6x33H1F7, geselecteerd voor de verdere evaluatie in vivo.
In hoofdstuk 4 werden de profibrinolytische eigenschappen van de parentale antilichamen of het corresponderende diabody (Db-TCK26D6x33H1F7) eerst onderzocht in een muis model van trombo-embolie, geïnduceerd door systemische toediening van weefsel factor. Hoewel de toediening van antilichamen, afzonderlijk of gecombineerd, slechts een half-maximale fibrineklaring veroorzaakte in de longen, resulteerde een overeenkomstige dosis van het diabody in een maximaal effect. Daarna werd in een muis model van cerebrale ischemie/reperfusie het diabody vergeleken met de antilichamen. Terwijl hier de afzonderlijke toediening van antilichamen bij een bepaalde dosis geen effect veroorzaakte, resulteerde de toediening van beide antilichamen of het diabody in een gereduceerde reperfusie-gemedieerde schade met kleinere lesievolumes en een verbeterde neurologische en motorische functie tot gevolg. Bovendien was het diabody effectiever in het verbeteren van de neurologische en motorische functie dan de combinatie van antilichamen. De superieure profibrinolytische capaciteit vanhet diabody is waarschijnlijk te wijten aan zijn relatief kleine (58 kDa) en flexibele structuur.
In hoofdstuk 5 werd de trombolytische capaciteit van Db-TCK26D6x33H1F7 beoordeeld door het diabody toe te dienen na trombusvorming in twee verschillende trombose-geïnduceerde CVA modellen. Het effect van het diabody werd telkens vergeleken met dat van tPA, gebruikt in de huidige behandeling van AIS. In het trombine-geïnduceerd model worden fibrine-rijke klonters gevormd die gevoelig zijn voor tPA-gemedieerde fibrinolyse. Na behandeling met het diabody werden de lesievolumes aanzienlijk gereduceerd 24 uur na het induceren van stroke, terwijlde tPA behandeling slechts een matig effect had. In het FeCl(3)-geïnduceerd model worden bloedplaatjes-rijke klonters gevormd die resistent zijn tegen tPA-gemedieerde fibrinolyse. Terwijl tPA inderdaad geen effect had, was het diabody in staat om de arterie te rekanaliseren, de hersendoorbloeding te verbeteren en lesievolumes te reduceren. Bovendien veroorzaakte het diabody, in tegenstelling tot tPA, geen verlengde bloedingstijden.
Kortom, deze studie toont aan dat de simultane inhibitie van twee antifibrinolytische proteïnes, TAFI en PAI-1, een sterk profibrinolytisch effect teweeg brengt in vivo. De twee belangrijkste uitkomsten van deze studie zijn dat (i) de simultane inhibitie van TAFI en PAI-1 door middel van het diabody effectiever is dan door de combinatie vantwee antilichamen en (ii) het diabody potenter, maar tegelijkertijd ookpotentieel veiliger, is dan tPA voor het behandelen van experimentele CVA.
Datum:1 okt 2009 → 22 sep 2014
Trefwoorden:diabody, fibrinolysis, PAI-1, TAFI
Disciplines:Ontdekking en evaluatie van biomarkers, Ontdekking en evaluatie van geneesmiddelen, Medicinale producten, Farmaceutica, Farmacognosie en fytochemie, Farmacologie, Farmacotherapie, Toxicologie en toxinologie, Andere farmaceutische wetenschappen, Diagnostiek, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project