< Terug naar vorige pagina
Project
De zoektocht naar kanker-gerelateerde biomerkers: een technologische uitdaging
De laatste jaren is duidelijk geworden dat de ontwikkeling van kanker niet alleen toe te schrijven is aan de (genetische) veranderingen van tumorcellen, maar dat de cellen die aanwezig zijn in de lokale micro-omgeving ook een zeer belangrijke rol spelen. De aanwezigheid van een leukocytinfiltraat is één van de belangrijkste componenten in deze tumor micro-omgeving en is verantwoordelijk voor één van de belangrijkste eigenschappen van kanker, namelijk de tumor-geassocieerde inflammatie. Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs), bijvoorbeeld, hebben een voorname rol in tumorprogressie en metastase. In deze thesis worden de resultaten voorgesteld van een geïntegreerde studie die het potentieel van deze inflammatoire cellen evalueert in de zoektocht naar kanker-gerelateerde biomerkers aan de hand van proteomica-technologie.
In een eerste deel van dit werk worden twee verschillende kwantitatieve proteomics methodes (twee-dimensionele differentiële gelelektroforese (2D-DIGE) en tandem mass tag (TMT) sixplex labeling) met elkaar vergeleken op basis van variatie-niveaus van peptiden en proteïnen in humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), een leukocyt-fractie die geïsoleerd wordt uit bloed. Met deze resultaten wordt een experimenteel ontwerp opgesteld dat kan dienen in klinische proteomics studies. Daarnaast wordt er ook een nieuwe normalisatiemethode (CONSTANd) voorgesteld, die het mogelijk maaktom in een TMT-gebaseerd proteomics experiment grotere groepen stalen (zowel intra- als inter-experiment) te vergelijken. Dit is momenteel niet mogelijk met de reguliere normalisatiemethoden, zoals kwantielnormalisatie.
In een tweede deel worden de geoptimaliseerde methodes geïmplementeerd in de context van kankerproteomica. In een eerste studie wordt duidelijk dat verschillen in het PBMC-proteoom van 10 gezonde vrijwilligersen 20 patiënten met colorectale kanker (CRC), toelaten om een onderscheid te maken tussen gezonde vrijwilligers en kankerpatiënten op basis van26 proteïnen. Een aantal proteïnen in deze set werden daarenboven in deliteratuur al beschreven als potentiële kankermerkers. In een tweede studie worden de tumor-stimulerende eigenschappen van macrofagen bestudeerd, in zowel een in vitro als een in vivo set-up. In beide gevallen kunnen de veranderingen in het proteïneprofiel van TAMs toegeschreven worden aan veranderingen in metabole signaalwegen. Dit suggereert dat macrofagen ook een belangrijke speler zijn in het parasitaire kankermetabolisme, waarbij stromale cellen energierijke nutriënten genereren door katabolisme en waarbij deze nutriënten worden opgenomen door de parasitaire kankercellen om zo tumorgroei te promoten. In een derde studie wordt ook het potentieel van formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel in kanker-gerelateerd biomerker-onderzoek bestudeerd. We tonen aan dat een TMTproteïnelabeling wel mogelijk is in deze stalen, maar dat er toch nog verschillende uitdagingen zijn, waaronder de identificatie van gecrosslinkte peptiden, wat dit weefsel suboptimaal maakt in de zoektocht naar kanker-gerelateerde biomerkers.
In het laatste deel testen we het potentieel van inductief-gekoppeld plasma- massaspectrometrie in fosfoproteomica-toepassingen. We tonen aan dat zowel het screenen naar veranderingen in de hoeveelheid aanwezige fosfopeptiden als de absolute kwantificatie ervan mogelijk is, maar dat de analyse van complexe biologische stalen toch nog een grote uitdaging blijft. Samengevat, tonen we met onze behaalde resultaten aan dat er potentieel zit in een proteoomanalyse van inflammatoire cellen in de context van kanker-gerelateerd biomerker-onderzoek. We tonen aan dat, met behulp van onze geoptimaliseerde methodes, verschillen in proteïneprofielen van deze inflammatoire cellen toelaten om tumorcondities te onderscheiden van gezonde condities. De behaalde resultaten zijn het startpunt voor een eerste validatie, waarbij deze resultaten uiteindelijk zouden kunnen leiden tot een set van selective en sensitieve merkers.
In een eerste deel van dit werk worden twee verschillende kwantitatieve proteomics methodes (twee-dimensionele differentiële gelelektroforese (2D-DIGE) en tandem mass tag (TMT) sixplex labeling) met elkaar vergeleken op basis van variatie-niveaus van peptiden en proteïnen in humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), een leukocyt-fractie die geïsoleerd wordt uit bloed. Met deze resultaten wordt een experimenteel ontwerp opgesteld dat kan dienen in klinische proteomics studies. Daarnaast wordt er ook een nieuwe normalisatiemethode (CONSTANd) voorgesteld, die het mogelijk maaktom in een TMT-gebaseerd proteomics experiment grotere groepen stalen (zowel intra- als inter-experiment) te vergelijken. Dit is momenteel niet mogelijk met de reguliere normalisatiemethoden, zoals kwantielnormalisatie.
In een tweede deel worden de geoptimaliseerde methodes geïmplementeerd in de context van kankerproteomica. In een eerste studie wordt duidelijk dat verschillen in het PBMC-proteoom van 10 gezonde vrijwilligersen 20 patiënten met colorectale kanker (CRC), toelaten om een onderscheid te maken tussen gezonde vrijwilligers en kankerpatiënten op basis van26 proteïnen. Een aantal proteïnen in deze set werden daarenboven in deliteratuur al beschreven als potentiële kankermerkers. In een tweede studie worden de tumor-stimulerende eigenschappen van macrofagen bestudeerd, in zowel een in vitro als een in vivo set-up. In beide gevallen kunnen de veranderingen in het proteïneprofiel van TAMs toegeschreven worden aan veranderingen in metabole signaalwegen. Dit suggereert dat macrofagen ook een belangrijke speler zijn in het parasitaire kankermetabolisme, waarbij stromale cellen energierijke nutriënten genereren door katabolisme en waarbij deze nutriënten worden opgenomen door de parasitaire kankercellen om zo tumorgroei te promoten. In een derde studie wordt ook het potentieel van formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel in kanker-gerelateerd biomerker-onderzoek bestudeerd. We tonen aan dat een TMTproteïnelabeling wel mogelijk is in deze stalen, maar dat er toch nog verschillende uitdagingen zijn, waaronder de identificatie van gecrosslinkte peptiden, wat dit weefsel suboptimaal maakt in de zoektocht naar kanker-gerelateerde biomerkers.
In het laatste deel testen we het potentieel van inductief-gekoppeld plasma- massaspectrometrie in fosfoproteomica-toepassingen. We tonen aan dat zowel het screenen naar veranderingen in de hoeveelheid aanwezige fosfopeptiden als de absolute kwantificatie ervan mogelijk is, maar dat de analyse van complexe biologische stalen toch nog een grote uitdaging blijft. Samengevat, tonen we met onze behaalde resultaten aan dat er potentieel zit in een proteoomanalyse van inflammatoire cellen in de context van kanker-gerelateerd biomerker-onderzoek. We tonen aan dat, met behulp van onze geoptimaliseerde methodes, verschillen in proteïneprofielen van deze inflammatoire cellen toelaten om tumorcondities te onderscheiden van gezonde condities. De behaalde resultaten zijn het startpunt voor een eerste validatie, waarbij deze resultaten uiteindelijk zouden kunnen leiden tot een set van selective en sensitieve merkers.
Datum:1 okt 2009 → 30 jun 2014
Trefwoorden:Cander, Mononuclear cell
Disciplines:Dierkundige biologie, Algemene biologie
Project type:PhD project