Evaluatie van de preproteïne-translocatiemotor SecA als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica

De strijd tegen bacteriële infecties is één van de grootste uitdagingen in de huidige geneeskunde door de snelle toename van antibioticumresistente bacteriën, die aan de basis liggen van moeilijk te behandelen infecties. Om deze infecties te bestrijden is er dringend nood aan nieuwe antibacteriële middelen, liefst gericht tegen alternatieve bacteriële doelwitten. Zo een mogelijk doelwit is de preproteïne-translocatiemotor SecA. SecA is een perifeer membraan-ATPase en een belangrijke component in de Sec-afhankelijke eiwittranslocatieweg, de belangrijkste route voor eiwittransport doorheen of in de bacteriële cytoplasmatische membraan. Aangezien SecA essentieel is voor de bacteriële levensvatbaarheid en alomtegenwoordig en sterk geconserveerd is in bacteriën, maar niet aanwezig is in eukaryote cellen, vormt het een interessant antibacterieel doelwit.

Om SecA te evalueren als doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica met een nieuw werkingsmechanisme, werd eerst een in silico analyse van verschillende SecA-structuren uitgevoerd om mogelijke “druggable” holtes op het oppervlak van SecA te identificeren. Een vergelijking van deze potentiële bindingsplaatsen voor kleine moleculen in de verschillende SecA-structuren toonde aan dat zes van deze holtes sterk geconserveerd zijn in zowel Gram-negatieve als Gram-positieve bacteriën.
Drie van deze geconserveerde holtes werden in meer detail bestudeerd om na te gaan of ze essentieel zijn voor de functie van SecA. Hiervoor werden in elk van deze drie voorspelde “druggable pockets” verschillende aminozuursubstituties geïntroduceerd, en dit gebeurde zowel voor SecA van de Gram-negatieve Escherichia coli als voor SecA1 van de Gram-positieve Staphylococcus aureus. Vervolgens werd het effect van deze substituties op de functie van SecA nagegaan met behulp van een in vivo genetische complementatietest. Hieruit bleek dat deze drie holtes essentieel zijn voor de functie van zowel E. coli SecA als S. aureus SecA1.  

Om te onderzoeken of deze voorspelde “druggable” holtes ook in werkelijkheid een geschikt doelwit voor kleine moleculen vormen, werd een structuurgebaseerde virtuele ligandscreening uitgevoerd. Circa 500 000 commercieel beschikbare, kleine moleculen van de ChemBridge chemische bibliotheek werden virtueel gescreend tegen één van de belangrijkste, essentiële holtes in E. coli SecA, namelijk deze gelegen in de signaalpeptidebindingsplaats. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een meerstappen, virtueel ligandscreeningsprotocol. De 1040 best scorende moleculen werden in vitro getest op hun capaciteit om de translocatie-ATPase-activiteit van SecA te remmen. Vijf inhibitoren van de translocatie-ATPase-, en niet van de basale of membraan-ATPase-activiteit, werden geïdentificeerd met IC50-waarden <65 µM. De meest potente inhibitor had een IC50 van 24 µM. Deze vijf inhibitoren werden eveneens getest op hun antimicrobiële capaciteit. Twee moleculen vertoonden zwakke antibacteriële activiteit tegen E. coli (IC50 ~198 µM), terwijl de anderen matige antibacteriële activiteit vertoonden tegen
S. aureus (IC50 ~100 µM). Deze moleculen zouden als “lead compounds” kunnen dienen voor het ontwikkelen van meer potente SecA-inhibitoren die de interactie tussen SecA en het preproteïne blokkeren en op die manier specifiek de Sec-afhankelijke eiwittranslocatie remmen.

Als een alternatieve manier om inhibitoren van SecA en/of de Sec-afhankelijke eiwittranslocatie te ontdekken, ontwikkelden we doelwitgerichte “whole-cell”-screening testen. Hiervoor werden recombinante E. coli-stammen aangemaakt waarvoor inhibitie van eiwittranslocatie eenvoudig kan gedetecteerd worden op basis van enzymactiviteit of fluorescentie. De ontwikkelde testen werden gevalideerd met behulp van de gekende SecA-inhibitor natriumazide en kunnen in de toekomst gebruikt worden voor het ontdekken van antibacteriële middelen die de Sec-afhankelijke eiwitsecretie inhiberen.

In deze studie hebben we aangetoond dat SecA een interessant doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica aangezien de bacteriële eiwittranslocatie kan geremd worden door kleine moleculen die gericht zijn tegen de signaalpeptidebindingsplaats van SecA, wat impliceert dat SecA “druggable” is. De geïdentificeerde SecA-remmers zijn de eerst beschreven inhibitoren van de SecA-preproteïne-interactie en zullen in de toekomst verder geoptimaliseerd moeten worden om hun antibacteriële activiteit en doeltreffendheid te verbeteren. Bijkomende in silico, in vitro en/of doelwitgerichte “whole-cell” screenings kunnen worden uitgevoerd om meer effectieve SecA- en/of Sec-afhankelijke eiwittranslocatie-inhibitoren te identificeren. Deze inhibitoren zullen hopelijk kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe antibiotica, die ingezet kunnen worden in de strijd tegen moeilijk te behandelen infecties veroorzaakt door multidrug-resistente bacteriën.