Studie van een signaalpeptide specifieke translocatie-inhibitor als een unieke down-modulator van CD4

Tijdens de biogenese van eukaryotische eiwitten zorgen signaalpeptiden in gesecreteerde en membraaneiwitten voor de selectieve lokalisatie van deze eiwitten naar het endoplasmatisch reticulum. De specifieke interacties tussen signaalpeptiden en de andere cellulaire componenten die instaan voor de translocatie en integratie van eiwitten in biologische membranen zijn echter nog niet volledig beschreven. In onze onderzoeksgroep werd eerder een kleine synthetische molecule genaamd CADA ontdekt, welke specifiek de synthese en export van humaan CD4 onderdrukt. CD4 is een belangrijke membraangebonden receptor, actief in immuuncellen en tevens de cellulaire receptor voor het humaan immunodeficiëntievirus. Recent werd door onze groep tevens aangetoond hoe de CD4 down-modulatie gekoppeld was aan het specifieke signaalpeptide van CD4 en zo aan selectieve inhibitie van co-translationele translocatie. Dit biedt ons een uniek systeem om eiwittranslocatie op moleculair niveau te onderzoeken.

In dit project werd een gedetailleerd model gemaakt van de interactie tussen een kleine chemische component (CADA), signaalpeptiden en de complexe cellulaire elementen van de eiwittranslocatieweg. De aminozuursequentie van signaalpeptiden is zeer divers, wat signaalpeptiden een interessant doelwit maakt voor de selectieve regulatie van eiwittranslocatie. Ons model zal leiden tot een diepere kennis van de functie van signaalpeptiden, en laat ons tevens toe om een efficiënt screening model op te stellen, wat gebruikt kan worden voor de screening van andere moleculen en signaalpeptide bibliotheken. Tevens verwachten we dat de resultaten van dit onderzoek gebruikt zullen worden voor de ontwikkeling van innovatieve antivirale en medicinale toepassingen.

Als eerste heb ik bijgedragen aan een systematische analyse naar het werkingsmechanisme van CADA. De aminoterminale regio van het CD4 pre-proteïne, waar het signaalpeptide zich bevindt, staat zelfstandig in voor CADA gevoeligheid. De CADA molecule reageert selectief met het signaalpeptide van CD4 en verhindert hierdoor de co-translationele translocatie van CD4 pre-proteïnen doorheen de membraan van het endoplasmatisch reticulum. Deze pre-proteïnen komen onder invloed van CADA foutief terecht in het cytosol, waar ze vervolgens afgebroken worden door het proteasoom. Onze observaties volgen het meest recente model voor predictie van signaalpeptide topologie: CD4 pre-proteïnen bevinden zich tijdens insertie in het translocon kanaal initieel in de ‘head-on’ oriëntatie, maar deze topologie inverteert na verlenging van de eiwitketen, waardoor een lus gevormd wordt en translocatie plaatsvindt. CADA verhindert de essentiële inversie van het signaalpeptide, waardoor tevens de verdere translocatie geblokkeerd wordt.

Het effect van CADA leek selectief te zijn voor de inhibitie van CD4. Daarom heb ik ook gezocht naar bijkomende doelwitten van deze molecule. Via een PowerBlot Western array werden de niveaus van meer dan 400 eiwitten in SUP-T1 cellen geëvalueerd voor en na behandeling met CADA, en werd sortiline ontdekt als een secundair substraat voor CADA. De expressie van sortiline wordt tevens gereduceerd via een signaalpeptide specifieke inhibitie van co-translationele translocatie door CADA, net zoals bij CD4.

Daarnaast beschreef ik de CD4 down-modulatie en antivirale activiteit van 28 nieuwe CADA analogen. Via deze kwantitatieve relatie tussen structuur en activiteit werd een correlatie geïdentificeerd tussen het dipoolmoment van de arenesulfonyl zijketens en de biologische activiteit van de moleculen. Bovendien toonde analoog CK147 de hoogste activiteit van alle analogen die tot nu toe getest waren, en deze is 6 keer meer actief dan CADA.

Tenslotte heb ik het model van het werkingsmechanisme van CADA verder verfijnd. Hiervoor werd de contributie van individuele aminozuren in het CD4 signaalpeptide voor CADA gevoeligheid bepaald via systematische mutagenese. Twee aminozuren in het signaalpeptide van CD4, Gln-15 en Pro-20, werden geïdentificeerd als essentiële elementen voor de werking van CADA. Daarnaast zijn positief geladen aminozuren in matuur proteïne gedeelte, welke direct C-terminaal na de signaalpeptide splitsingsplaats gelegen zijn, tevens vereist voor volledige gevoeligheid aan CADA. Analyse van het sortiline signaalpeptide suggereerde echter dat de primaire eiwitstructuur op zich onvoldoende informatie verschaft om CADA gevoeligheid te voorspellen, daar CADA waarschijnlijk een specifieke driedimensionale positionering vereist van een aantal essentiële aminozuren in het signaalpeptide en daaropvolgende regio uit het mature proteïne.