Metabole modellering en engineering van Streptomyces lividans voor optimalisering van heterologe eiwitproductie.

Industriële biotechnologie heeft in de afgelopen decennia een enorme groei vertoond, voornamelijk dankzij zijn duurzaam karakter in vergelijking met klassieke chemische processen. Om deze groei te kunnen aanhouden worden verschillende micro-organismen bestudeerd als potentiële celfabrieken. Streptomyces lividans wordt bijvoorbeeld beschouwd als een veelbelovende gastheer voor de productie van heterologe eiwitten. Om stamverbetering rationeel mogelijk te maken is echter een grondige kennis vereist over de impact van de expressie van heterologe genen op het celmetabolisme.       

Dit proefschrift richt zich op het ontrafelen van de metabolic burden in S. lividans TK24 veroorzaakt door de expressie van een heteroloog gen. Hiertoe wordt een 13C-metabole fluxanalyse van een cellulase A producerende stam vergeleken met een referentiestam dat het lege plasmide bevat. Deze analyse leidt tot een kwantitatieve evaluatie van de fluxen in het centrale koolstofmetabolisme tijdens de exponentiële groeifase. Deze 13C-metabole fluxanalyse is de eerste in zijn soort zowel binnen de onderzoeksgroep als voor een heteroloog eiwitproducerende S. lividans in het algemeen.        

Aangezien de nauwkeurigheid van de fluxschatting in 13C-metabole fluxanalyse sterk wordt beïnvloed door de gebruikte 13C-substraten, worden labo-experimenten voorafgegaan door een optimale experimentele ontwerpstudie. Een compleet framework voor kostefficiënt ontwerp van 13C-tracer experimenten is opgebouwd en geïllustreerd op twee verschillende metabole modellen om het generieke karakter van de methode aan te tonen. Een eerste stap is de bepaling van het optimale ontwerp op basis van een gelineariseerde en een niet-lineaire modelleringsmethode. In beide gevallen kan de waarde van een substraatmengsel geëvalueerd worden op basis van een scalair criterium, respectievelijk het D-criterium en het S-criterium. Beide methodes leiden tot hetzelfde optimale ontwerp. Het optimaal ontwerp framework van 13C-tracer experimenten is vervolgens uitgebreid met een gelijktijdige kostenminimalisatie. Optimale mengsels worden verkregen die evenwaardig zijn aan het waardevolle 1,2-GLC, maar beduidend goedkoper zijn. Dit bevestigt de relevantie van een a priori experimenteel ontwerp bij het bestuderen van een nieuw organisme of stam. De multi-objectieve aanpak biedt ook een manier om het verlies aan nauwkeurigheid van de fluxschatting te evalueren wanneer het budget beperkt is.       

Fluxverdelingen in het centrale koolstofmetabolisme zijn uiteindelijk berekend voor een recombinante S. lividans stam, die een thermostabiel cellulase produceert, en een S. lividans referentiestam. Een uitgebreide, stationaire 13C-metabolische fluxanalyse is toegepast op beide stammen, inclusief de toepassing van het geïmplementeerde optimale experimentele ontwerp framework. Batch tracer experimenten zijn uitgevoerd in duplo met het optimale glucosemengsel. Massaisotopomeerfracties zijn verkregen via GC-MS-analyses van eiwitgebonden aminozuren. De meest nauwkeurige fluxschattingen zijn uiteindelijk verkregen door de experimentele data van twee tracer experimenten simultaan te fitten. Hierdoor is mogelijke biologische variabiliteit ook in rekening gebracht. Dit kader vormt de basis voor alle toekomstige 13C-metabole fluxanalyses in de onderzoeksgroep.      

De CelA-producerende stam vertoont een duidelijke metabole shift in vergelijking met de referentiestam. De meest opvallende verschillen zijn de verhoogde secretie van organische zuren en de verhoogde flux door de pentosefosfaatcascade en de citroenzuurcyclus. Dit leidt tot een overmatige cofactorgeneratie. De verhoogde secretie van organische zuren wijst op een ongebalanceerde productie van metabole precursoren.

De gekwantificeerde impact van de introductie van een heteroloog gen in S. lividans kan nu aangewend worden om stamverbetering rationeel uit te voeren. Een verhoogde flux door de pentosefosfaatcascade wordt typisch waargenomen tijdens een verhoogde eiwitproductie in andere heteroloog eitwitproducerende micro-organismen, en wordt opnieuw bevestigd voor S. lividans. Overexpressie van deze genen biedt een eerste rationele strategie voor stamverbetering van S. lividans op basis van fluxanalyses. Bovendien kan de verkregen fluxmap gebruikt worden als aanvullende fluxbeperkingen tijdens genoom-gebaseerde simulaties van genetische modificaties. De uiteindelijke bekomen stammen kunnen daarna eenvoudig worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van een framework voor kostefficiënte 13C-MFA.