< Terug naar vorige pagina

Project

Regulatie van de lokale schildklierhormoonbeschikbaarheid in de ontwikkelende hersenen bij de kip.

Schildklierhormonen (THs) zijn belangrijke regulatoren van de ontwikkeling in vertebraten. Afwijkende TH-niveaus kunnen leiden tot een verstoorde ontwikkeling, zoals bijvoorbeeld het optreden van een mentale achterstand. Om de onderliggende processen beter te begrijpen, bestudeerden we de invloed van THs op de vroege ontwikkeling, met het kippenembryo als onderzoeksmodel. Vooraleer we de toevoer aan THs in specifieke weefsels en celtypes echter kunnen bestuderen (en beïnvloeden), moeten de proteïnen die de beschikbaarheid van THs controleren functioneel gekarakteriseerd en gelokaliseerd worden.

TH-transmembraantransporters zijn cruciaal in het leveren van THs aan doelwitcellen, waarvan de ontwikkeling afhangt van een correcte TH-actie. Het kippenembryo wordt reeds lange tijd beschouwd als een waardevol diermodel in ontwikkelingsonderzoek, maar de enige TH-transporter die tot nu toe functioneel gekarakteriseerd werd, is de organic anion transporting polypeptide 1C1 (OATP1C1). Daarom kloneerden we nu ook de large amino acid transporter 1 (LAT1) en de monocarboxylate transporters 8 (MCT8) and 10 (MCT10) in de kip. Vervolgens werden deze transporters, samen met het eerder gekloneerde OATP1C1, functioneel gekarakteriseerd met behulp van JEG3, COS1 en DF-1 cellen. De karakteristieken van deze vier kippen TH-transporters bleken erg gelijkend aan deze van hun zoogdier ortologen. MCT8 en OATP1C1 hebben beide een hoge affiniteit voor het prohormoon T4, terwijl het receptor-actieve T3 het meeste getransporteerd wordt door MCT8 en MCT10. Deze laatste transporter vertoont een lagere affiniteit, maar heeft een hoge Vmax en lijkt erg efficient in T3 export. Ook LAT1 heeft een relatief lage affiniteit voor zijn voorkeursubstraat 3,3'-T2. Reverse T3, ten slotte, wordt door de vier proteïnen getransporteerd en is vooral een goed exportproduct voor OATP1C1.

In een tweede luik van de thesis localiseerden we MCT8, MCT10, OATP1C1, LAT1 en de respectievelijke TH-activerende en -inactiverende dejodasen type 2 (D2) en 3 (D3) met behulp van in situ hybridisatie in weefsels van 6, 10 en 18 dagen oude embryos (E6-18). Expressie van deze verschillende genen werd teruggevonden in verschillende organen, maar was leeftijdsafhankelijk. Voorbeelden zijn lever (MCT10), hart (D2), nieren (MCT8) en testis (MCT8, D3). MCT10 en LAT1 waren op alle stadia aanwezig in de pancreas. Een erg gelijkend expressiepatroon voor LAT1 en het preproproteïne voor glucagon kon onderscheiden worden, waardoor we vermoeden dat deze transporter aanwezig is in de α-cellen van de pancreas. Op variërende tijdstippen tijdens de ontwikkeling van het oog vonden we expressie van de bestudeerde genen in lens (LAT1), corpus ciliare (MCT10, LAT1, OATP1C1) en retina (MCT8, LAT1D2, D3). Ook in de hersenen van het kippenembryo detecteerden we een signaal voor elk van de geteste genen, verspreid over neuronen, gliacellen en -vooral- beide barriëres: de choroïd plexus en de bloed-hersenbarriëre. In bloedvaten in zowel de hersenen als het ruggenmerg kwamen LAT1 en D2 samen tot expressie, terwijl MCT8 zich in de grijze stof bevond. Bovenop de vermelde genen, bestudeerden we ook het expressiepatroon van 4F2 cell-surface antigen heavy chain (4F2hc), dat codeert voor het hulpproteïne dat LAT1 begeleidt tot aan het plasmamembraan. In weefsels die LAT1 sterk tot expressie brachten, zoals bijvoorbeeld ogen en pancreas, vonden we ook een signaal voor 4F2hc, wat de veronderstelde interactie ondersteunt. Samengenomen toont de sterke, leeftijdsafhankelijke expressie van een arsenaal aan TH-regulerende genen dat organen zoals pancreas, oog, en vooral hersenen, sterk afhangen van THs voor hun ontwikkeling.

Ten slotte onderzochten we de functie van THs in de vroege ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel. Hiervoor verwezelijkten we een knockdown van MCT8 in de retina vanaf E4 met behulp van een RNA-interferentie construct en bestudeerden we het fenotype op E6. Wanneer we de data die eerder door onze onderzoeksgroep werd verzameld, combineren met de informatie uit deze thesis zien we dat de afwezigheid van MCT8 leidt tot een vermindering in proliferatie van progenitorcellen en lagere aantallen fotoreceptoren, ganglioncellen en, hoewel niet significant, horizontale cellen. We veronderstellen dat de vermindering in gedifferentieerde cellen deels te wijten is aan de daling in proliferatie. De mRNA-expressie van THRα en de proteïnelabelling van PAX6 leek ongewijzigd door knockdown van MCT8.

Deze thesis vormt een relevante bijdrage aan de waarde van het kippenembryo als diermodel in TH-onderzoek. De functionele karakterisatie van de verschillende TH-transporters en de bepaling van expressiepatronen van zowel deze proteïnen als de dejodasen doorheen de ontwikkeling, zijn beide cruciaal om verdere experimenten op te stellen en te interpreteren. Bovendien toonde onze knockdownstudie alvast aan dat MCT8 belangrijk is in de vroege ontwikkeling van de retina. Samen met eerdere studies van de ontwikkelende hersenen, illustreert dit het belang van THs reeds vanaf de vroege stadia in de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.

Datum:1 okt 2012 →  28 mrt 2017
Trefwoorden:Embryonic, Chicken, Brain development, Deiodinases, Transporters, Thyroid hormones
Disciplines:Dierkundige biologie, Genetica, Endocrinologie en metabole ziekten
Project type:PhD project