< Terug naar vorige pagina

Project

De studie van HIV-1 uncoating met behulp van superresolutie microscopie.

Onderzoek van individuele virussen met fluorescentiemicroscopie is een krachtig instrument om de replicatiecyclus van HIV-1 te bestuderen. Deze wordt namelijk gekarakteriseerd door een grote heterogeniteit, snelle gebeurtenissen van korte duur en een aantal essentiële interacties tussen het virus en zijn gastheer. Het specifiek labelen van virale proteïnen, zonder dat de replicatiecompetentie van het virus verloren gaat, maakt het mogelijk om individuele fasen van de replicatiecyclus in zowel tijd als ruimte te onderzoeken. In deze thesis wordt het lot van fluorescent gelabeld HIV-1 integrase en capside tijdens de vroege stappen van de replicatiecyclus geanalyseerd, op het niveau van individuele virussen.

HIV-1 integrase (IN) katalyseert de integratie van het virale genoom in het genoom van de geïnfecteerde gastheercel. Dit virale enzym heeft verschillende cellulaire interactiepartners; TRN-SR2 speelt een rol bij de nucleaire import van HIV-1, terwijl LEDGF/p75 het pre-integratie complex (PIC) met het chromatine van de gastheer connecteert en zorgt voor een preferentiële integratie in actief chromatine. LEDGINs zijn antiretrovirale middelen gericht tegen deze LEDGF/p75-IN interactieplaats. Ze concurreren met LEDGF/p75 om aan IN te kunnen binden en veroorzaken bovendien multimerisatie van IN.

HIV-1 capsidemoleculen (CA) verenigen zich ter vorming van een kegelvormige capsidestructuur, waarin het virale RNA en de virale enzymen zich bevinden. Het noodzakelijke verliesmechanisme van deze capsidemantel is echter niet in detail gekend. Bovendien heeft CA verschillende cellulaire interactiepartners, en speelt het een rol tijdens reverse transcriptie, capside-ontmanteling, vervoer in het cytoplasma en import in de nucleus.

In het eerste deel van deze thesis werden individuele virussen bestudeerd met behulp van confocale fluores-centiemicroscopie, waarbij HIV-1 IN fluorescent gelabeld was. Dit maakte het mogelijk om de hoeveelheid IN-moleculen en de cellulaire distributie van de virale complexen in een geïnfecteerde cel te bepalen. Zowel de labelingsstrategie als de analysemethode werden gevalideerd. We toonden aan dat nucleaire virale complexen minder IN-moleculen bevatten ten opzichte van cytoplasmatische virale complexen. Dit was onafhankelijk van de cellulaire cofactoren TRN-SR2 en LEDGF/p75 en van de virale DNA-flap, waarvan thans gesuggereerd wordt dat het een rol speelt bij de nucleaire import. Bovendien bleek ook de integratie van het virus geen vereiste te zijn voor het lage aantal IN-moleculen in de nucleus. We maken dan ook de hypothese dat de nucleaire porie zich gedraagt als een moleculaire filter, waarbij het enkel voor PIC's die weinig IN-moleculen bevatten mogelijk is om de nucleus te betreden. Deze hypothese wordt bevestigd door het feit dat virussen die geproduceerd zijn in de aanwezigheid van LEDGINs de nucleus niet kunnen betreden, wat vermoedelijk het resultaat is van het hogere aantal IN-moleculen in cytoplasmatische complexen.

In het tweede deel hadden we tot doel om een functioneel virus te ontwikkelen waarvan het capside op een directe wijze gelabeld was, en dusdanig de analyse van individuele virussen in levende cellen toeliet. We onderzochten het potentieel van verschillende posities in CA om een eGFP- of FlAsH-label te plaatsen. We stelden echter vast dat een mix van gelabelde en niet-gelabelde CA-moleculen noodzakelijk was om de virale replicatiecompetentie te behouden. We toonden aan dat complexen met CA, maar zonder IN, accumuleren in de perinucleaire omgeving. Bovendien bevestigden we dat CA aanwezig is in de nucleus, hoewel de rol en aard van dit nucleaire CA onduidelijk blijft. Verrassend genoeg verschilt de hoeveelheid CA dat aanwezig is in nucleaire complexen nauwelijks van de hoeveelheid CA in cytoplasmatische complexen. Deze waarneming kan echter het gevolg zijn van een lage labelingsdichtheid. Verdere validatie van deze CA-gelabelde virussen is noodzakelijk om te bepalen of deze daadwerkelijk toepasbaar zijn om het verlies van de capsidemantel te bestuderen.

In het derde hoofdstuk hadden we initieel tot doel om een tweekleuren-superresolutiestudie uit te voeren, gebruik makend van IN-mEos3.2 gelabelde virussen en cellulaire proteïnen die gevisualiseerd kunnen worden met behulp van gelabelde antilichamen. Dit zou toelaten om interacties tussen het virus en de gastheer tot in moleculair detail te bestuderen. Echter, de far-red organische kleurstoffen, die vast gehecht zijn aan het antilichaam, fotoconverteerden naar een derivaat met een blauw-verschoven emissie wanneer het staal met intens 561 nm licht beschenen werd. We toonden aan dat dit derivaat gradueel gevormd werd tijdens een intramoleculaire, irreversibele fotogeïnduceerde chemische reactie. Dit heeft aanzienlijke gevolgen voor tweekleuren superresolutiemicroscopie, aangezien de emissie van het derivaat in het spectrale gebied van de rode vorm van mEos3.2 ligt.

Samengevat hebben we een instrument ontwikkeld dat toelaat om de cellulaire distributie van virale proteïnen op het niveau van individuele virussen op een kwantitatieve manier te bestuderen. Dit gaf ons de mogelijkheid om essentiële fasen van de replicatiecyclus van HIV-1 te onderzoeken, waaronder nucleaire import. Bovendien konden de actiemechanismen van antiretrovirale middelen bestudeerd worden.

Datum:1 okt 2012 →  18 nov 2016
Trefwoorden:Super-resolution microscopy, HIV-1, Capsid, FlAsH, Uncoating
Disciplines:Anorganische chemie, Organische chemie, Theoretische en computationele chemie, Andere chemie, Fysische chemie, Duurzame chemie
Project type:PhD project