Identificatie en optimalisatie van ethanoltolerantiemechanismen in Escherichia coli door middel van experimentele evolutie.

De fossiele brandstofreserves blijven slinken terwijl de vraag naar energie steeds groter wordt. Daarom wordt het oplossen van het energievraagstuk één van de grootste uitdagingen voor de mensheid in de 21ste eeuw. De afgelopen jaren werd reeds veel tijd en moeite gestoken in het vergemakkelijken van de overgang van fossiele brandstof naar hernieuwbare bio-brandstof. Vooral bio-ethanol kreeg veel aandacht en het gebruik hiervan is momenteel reeds goed geïntegreerd in onze maatschappij. Deze ethanol wordt geproduceerd in een fermentatieproces door micro-organismen, zoals gist en Escherichia coli, die suiker omzetten in alcohol. Het grootste obstakel hierbij is de toxiciteit van ethanol. Wanneer een organisme ethanol produceert, wordt het ook blootgesteld aan steeds hogere concentraties waardoor de productie uiteindelijk stilvalt. Daarom is het begrijpen en verhogen van ethanoltolerantie enorm belangrijk om het productieproces te optimaliseren en de prijs van bio-ethanol te verlagen zodat het de concurrentie kan aangaan met fossiele brandstoffen. Ondanks het belang van ethanoltolerantie, blijft dit fenotype toch weinig begrepen in E. coli. Daarom lag de focus van dit werk op verschillende aspecten van ethanoltolerantie in E. coli, gaande van de evolutionaire processen onderliggend aan adaptatie aan hoge ethanolconcentraties tot de genetische basis van ethanoltolerantie en het fysiologisch effect van ethanol op E. coli.

Ethanoltolerantie is een complex fenotype dat meerdere mutaties vereist aan-gezien het bepaald wordt door een netwerk van genen die met elkaar interageren. Bovendien is ethanol toxisch voor E. coli waardoor blootstelling kan leiden tot het afsterven van de cel. Om ethanoltolerantie te bestuderen gebruikten we experimentele evolutie. Dit werk levert voor het eerst inzicht in de evolutionaire dynamiek die aan de basis ligt van adaptatie aan zeer hoge ethanolconcentraties. Verrassend genoeg bleek dat enkel lijnen met een verhoogde mutatiesnelheid in staat waren te evolueren naar hoge ethanoltolerantie (tot 8.5%). Bovendien tonen we aan dat een hoge mutatiesnelheid ervoor zorgt dat er voldoende genetische variatie in de populatie optreedt om adaptatie op korte termijn mogelijk te maken en zo uitsterven te vermijden. We observeerden ook een opvallend grote flexibiliteit in de mutatiesnelheid van de populatie tijdens adaptatie aan steeds toenemende ethanolconcentraties. Specifiek steeg de mutatiesnelheid bij blootstelling aan hogere ethanolconcentraties en daalde de mutatiesnelheid wanneer de populatie aangepast was aan die concentratie. Dit steeds op- en neergaan van de mutatiesnelheid werd meerdere opeenvolgende keren waargenomen, wat wijst op een enorm genetisch potentieel in E. coli voor het aanpassen van de mutatiesnelheid. Daarenboven konden we de mortaliteit als onderliggende drijvende kracht van de veranderingen in mutatiegraad identificeren. De bevindingen uit dit hoofdstuk werpen een nieuw licht op evolutie in stressvolle condities en kunnen ze implicaties hebben voor andere relevante situaties zoals bacteriën die blootgesteld worden aan lethale antibiotica of kankercellen die behandeld worden met chemotherapie. In deze gevallen kan hypermutatie een uitweg bieden om zulke condities te overleven. Daarom zou het laag houden van de mutatiegraad een bijkomend objectief kunnen zijn om in de toekomst antibioticumresistentie en herval van kanker te verminderen.

Hoewel een verhoogde mutatiesnelheid nodig bleek om sterk ethanoltolerante stammen te bekomen, zorgde dit ook voor een veel hogere complexiteit van de sequentiedatasets van deze stammen. Daarom hebben we IAMBEE (Identificatie van Adaptieve Mutaties in Bacteriële Evolutie Experimenten) ontwikkeld. Deze tool maakt gebruik van het verschil in frequentie van een mutatie voor en na een sterke fenotypisch verandering en een score die de impact van de mutatie op eiwitniveau weergeeft. Beide parameters worden vervolgens in een netwerkanalyse gebruikt om reactiepaden te identificeren waarin mutaties verhoogde ethanoltolerantie kunnen veroorzaken. Op deze manier konden we onder andere veranderingen in vetzuursamenstellingen en veranderingen in multi-drug effluxpompen identificeren en hun rol bevestigen. Daarnaast bleek ook verhoogde transcriptie- en translatiebetrouwbaarheid belangrijk te zijn. De geïdentificeerde doelwitten kunnen in de toekomst dienen als basis voor het optimaliseren van productieorganismen. Om de geïdentificeerde mutaties verder te onderzoeken, werden enkele hiervan reeds enkelvoudig aangebracht in de wildtype stam door middel van een eigen ontwikkelde genoom modificatie methode.  

Ten slotte werden verschillende componenten van ethanol-geïnduceerde mutagenese geïdentificeerd. Ethanol zorgt hierbij voor oxidatieve stress, al dan niet via lipideperoxidatie. De reactieve zuurstof species veroorzaken DNA schade, wat op zijn beurt de SOS-respons activeert en zorgt voor overexpressie van error-prone polymerases die de DNA schade mutageen herstellen. Er moeten echter nog experimenten uitgevoerd worden om dit systeem volledig te begrijpen.

Dit doctoraat draagt bij tot het begrijpen van adaptatie in extreem stressvolle omgevingen, wat op termijn kan leiden tot de ontwikkeling van anti-evolutie therapieën en een snelle methode voor het genereren van gewenste fenotypes. IAMBEE is toepasbaar op andere complexe datasets en de CRISPR-gebaseerde methode is bruikbaar voor andere onderzoekers die werken op E. coli maar ook voor het ontwikkelen van een gelijkaardige strategie voor andere organismen. Tot slot kunnen de geïdentificeerde mutaties dienen als basis voor het verder optimaliseren van een ideaal productieorganisme voor de bio-ethanolindustrie.