Het kippencerebellum als model voor het bestuderen van de impact van monocarboxylaat transporter 8 deficiëntie tijdens de vroege hersenontwikkeling

Schildklierhormonen (TH’s) zijn essentieel voor een normale hersenontwikkeling bij vertebraten via het coördineren van verscheidene processen die zich afspelen in de ontwikkelende hersenen. Naast de beschikbaarheid van voldoende hoge hoeveelheden TH’s, is ook een correcte timing van TH-toevoer naar verschillende hersencellen tijdens hun ontwikkeling van cruciaal belang voor het correct functioneren van de hersenen. De precisie waarmee de lokale beschikbaarheid van TH’s wordt gereguleerd, is het resultaat van een nauwe interactie tussen enerzijds TH-transporters die zorgen voor de opname van TH’s in de cel en anderzijds dejodasen die instaan voor het activeren en inactiveren van intracellulaire TH’s. Hoewel de gevolgen van een tekort aan TH’s tijdens de hersenontwikkeling reeds behoorlijk goed werden beschreven, blijft het werkingsmechanisme van TH’s in de ontwikkelende hersenen nog grotendeels onopgehelderd. In deze thesis gaan we specifiek in op de functionele betrokkenheid van de monocarboxylaat transporter 8 (MCT8) tijdens de vorming van het neuraal netwerk in het cerebellum door het toepassen van een knockdown strategie in het kippenembryo.

Om een algemeen beeld te krijgen van de mate waarin het ontwikkelend cerebellum afhankelijk is van TH’s, werd het cel-specifieke expressiepatroon van TH transporters en dejodasen bepaald. Onze resultaten toonden vooreerst het weefsel- en cel-specifieke expressiepatroon aan van genen die vereist zijn voor de uitwisseling van TH’s tussen hersencellen en voor de (in)activatie van TH’s in het ontwikkelend cerebellum. Hierbij vormt de differentiële expressie van TH-regulerende genen een indicator voor de TH-afhankelijkheid van een bepaald celtype op een gegeven moment tijdens de ontwikkeling. Purkinjecellen (PC’s) vormen de enige output van het cerebellum en zijn afhankelijk van TH’s voor hun ontwikkeling. Dit en de sterke expressie van MCT8 in PC’s wijzen erop dat MCT8 wellicht een belangrijke rol vervult in de opname van het receptor-actieve hormoon 3,5,3’-trijoodthyronine (T3) in neuronen van het centraal zenuwstelsel.

Om de rol van MCT8 te bestuderen tijdens TH-afhankelijke cellulaire processen die de ontwikkeling van het cerebellum sturen, werd een strategie ontwikkeld om de expressie van MCT8 en bijgevolg de lokale TH-concentraties te reduceren in het cerebellum. Hiervoor creëerden we gen-specifieke RNA interferentie (RNAi) vectoren gebaseerd op de pRFPRNAiA en RCASARNAi vectoren die specifiek werden ontwikkeld voor optimale knockdown van genen in de kip. De pRFPRNAiA vector is een standaard plasmide vector, terwijl de RCASARNAi vector een voorloper vormt van een gemodificeerd RCAS virus. Uit de in vitro testen bleek dat beide RNAi vectoren de MCT8 mRNA expressie efficiënt reduceren. Om deze RNAi vectoren ook in vivo te kunnen gebruiken, werd een methode ontwikkeld voor in vivo transfectie van het cerebellum. Door het uitvoeren van gerichte elektroporatie op dag 3 van de embryonale ontwikkeling waren we in staat om efficiënt verschillende celtypes te transfecteren in het cerebellum, zoals werd nagegaan in embryo’s van 6 tot 18 dagen oud. Terwijl de niet-virale vector overwegend tot expressie werd gebracht in PC’s en cerebellaire kernen in één helft van het cerebellum, vertoonde de RCAS vector een wijdverspreide expressie in granulaire cellen (GC’s) in het volledige cerebellum.

Om de effecten van MCT8 knockdown te bestuderen op de organisatie van het neuraal netwerk in het cerebellum maakten we gebruik van de niet-virale MCT8 RNAi vector. Dit liet ons toe om specifiek de expressie van MCT8 te manipuleren in ontwikkelende PC’s. Uit de resultaten bleek dat de MCT8 transporter een belangrijke factor is voor het controleren van de T3-toevoer naar neuronen. Deze regulatie op zich draagt in belangrijke mate bij tot het coördineren van processen zoals differentiatie van PC’s en proliferatie van GC’s via interactie tussen TH’s, Retinoic acidreceptor-related orphan receptor alpha (RORα) en Sonic hedgehog (SHH). Het model dat werd gebruikt in dit werk heeft ons nieuwe inzichten verleend in de signaalwegen die mogelijks verstoord worden bij deficiëntie van de MCT8 transporter in het cerebellum bij de mens. Bovendien biedt onze strategie nieuwe mogelijkheden om de functionele betrokkenheid van andere TH-regulerende genen te onthullen en vormt bijgevolg een belangrijke volgende stap naar een beter begrip van de onderliggende mechanismen van TH-werking tijdens de ontwikkeling van de hersenen.