Bioassay ontwikkeling voor ultragevoelige affiniteit-gebaseerde detectie van influenza A nucleoprotein

Micro-organismen spelen een belangrijke rol in het dagelijkse leven van de mens. Ze dragen bij tot het produceren van voedsel maar zijn ook de oorzaak van heel wat ziekten. In geval van virale en bacteriële infecties zijn een vroege diagnose en een correcte behandeling cruciaal om de kansen op herstel te vergroten. Snelle diagnostische testen zijn echter niet altijd beschikbaar of voldoen niet aan belangrijke vereisten zoals gevoeligheid, specificiteit en kostprijs. Er wordt dan ook intensief onderzoek verricht om testen te ontwikkelen die aan deze noden tegemoet komen. Dit wordt geïllustreerd door de verwachting dat de globale in vitro diagnostiekmarkt een waarde van 75.1 miljard dollar zal bereiken in 2020.

Hoewel niet-overdraagbare aandoeningen de belangrijkste doodsoorzaak zijn wereldwijd, blijven infectieziekten een grote invloed hebben met 13 miljoen doden in 2013. Het influenzavirus is een van de vele pathogenen die infecties kunnen veroorzaken en is verantwoordelijk voor de jaarlijkse griepepidemieën. Een infectie kan soms zelfs leiden tot de dood van de patiënt. Tijdige diagnose is dus cruciaal om de infectie snel onder controle te krijgen. De huidige snelle diagnostische testen voldoen echter niet aan de vereiste behoeften (gevoelig, gebruiksvriendelijk, goedkoop en robuust).

In dit doctoraat werden bioherkenningselementen zoals aptameren en antilichamen, gericht tegen het influenza A nucleoproteïne, geselecteerd en grondig gekarakteriseerd met als doel deze te implementeren in nieuwe bioanalytische technologieën voor de affiniteit-gebaseerde detectie van influenza. Hoewel dit type testen nog steeds niet de gevoeligheid van moleculaire detectie benaderden, hebben ze toch een aantal belangrijke voordelen, zoals hun lage complexiteit en kost.

In het eerste deel van dit werk werd gefocust op de selectie van aptameren tegen het influenza A nucleoproteïne. Deze DNA-gebaseerde bioreceptoren  vormen een veelbelovend alternatief voor antilichamen. De aptameren werden geselecteerd via een iteratieve selectieprocedure (SELEX), gebruikmakend van magnetische micropartikels. Voor elke selectieronde werd een extra stap geïntroduceerd om de specificiteit van de aptameren te verhogen en aspecifieke adsorptie met de partikels te vermijden. Zo werden aptameren met een hoge affiniteit voor hun target geïdentificeerd.

Vervolgens werd het potentieel van een nieuwe bioanalytische technologie  (EvalutionTM) onderzocht voor de hoge-doorvoer kinetische karakterisatie van aptameerkandidaten. Twee unieke eigenschappen van het systeem bleken zeer waardevol in deze studie, namelijk (1) gecodeerde micropartikels die toelaten om een multiplexanalyse uit te voeren en (2) een volledig geautomatiseerde microfluidische omgeving met 16 kanalen. De verkregen resultaten werden vergeleken met deze van een referentietechnologie (Biacore) en onthulden dissociatieconstanten met nanomolaire waarden.

Aangezien antilichamen nog vaak de bioherkenningsmoleculen bij voorkeur zijn, werden zeven commercieel beschikbare antilichamen tegen het influenza A nucleoproteïne onderzocht met behulp van ELISA en SPR-gebaseerde bioanalytische technieken. De antilichamen vertoonden een sterk verschillend gedrag afhankelijk van de gebruikte meettechniek en de testomstandigheden. Twee antilichamen gaven op beide platformen een goede bindingscapaciteit hoewel ze niet de hoogste affiniteit vertoonden. Dit toonde duidelijk aan dat verschillende parameters in rekening gebracht dienen te worden bij het ontwikkelen van nieuwe testen.

De mogelijkheid die EvalutionTM biedt om hoge-doorvoer multiplexanalyses uit te voeren, maakt het een handig platform voor de snelle ontwikkeling van nieuwe testen. Gebruikmakend van EvalutionTM werden drie antilichamen getest voor hun binding met het nucleoproteïne. Deze studie toonde aan dat het platform: (1) toelaat om snel een multiplexanalyse uit te voeren van de bindingskarakteristieken van antilichamen, (2) detectielimieten haalt die vergelijkbaar zijn met standaard ELISA-technologie en (3) toelaat om testen uit te voeren in een complexe staalmatrix. Dit illustreert het potentieel van EvalutionTM als alternatief voor de bestaande ELISA en SPR-systemen.

In het laatste deel werd een antilichaampaar geïmplementeerd op een in het labo ontwikkeld digitaal ELISA platform voor de zeer gevoelige detectie van influenza A nucleoproteïne. Detectielimieten van 4 ± 1 fM en 10 ± 2 fM werden bereikt in respectievelijk buffer en wissers van de nasofarynx. Hierbij werd dezelfde gevoeligheid verkregen als bij de huidige snelle moleculaire testen. Bijgevolg kan geconcludeerd worden dat digitale ELISA een enorm potentieel heeft voor de ontwikkeling van extreem gevoelige affiniteit-gebaseerde diagnostische tests.