Trehalose-6-fosfaat (T6P), een nieuwe regulator van de SnRK1-energiesensor in planten als doelwit voor het verhogen van de stresstolerantie.

Het SnRK1 (SNF1-related kinase1) proteïnekinase, het plant ortholoog van gist SNF1 (Sucrose non-fermenting1) kinase en AMPK (AMP-activated protein kinase) in dieren, fungeert als een centrale metabole sensor. Het integreert endogene ontwikkelingssignalen en verscheidene stress-condities (die de fotosynthese, respiratie of koolstofverdeling aantasten) in een geïntegreerde respons om de cellulaire energiehomeostase en overleving te verzekeren. Naast een ingrijpende metabole en transcriptionele herprogrammatie, leidt dit ook tot een remming van de groei. Het exacte moleculaire mechanisme dat SnRK1 activeert bij gebrek aan energie en hoe groei en ontwikkeling beïnvloed worden, blijft echter onduidelijk.

Om deze vragen in meer detail te bestuderen, hebben we eerst een reporter ontwikkeld en geoptimaliseerd om de in vivo SnRK1 activiteit te evalueren. Deze reporter is gebaseerd op een peptide-sequentie van het goed gekarakteriseerde AMPK-doelwit Acetyl CoA Carboxylase1 (ACC1) met de fosforylatieplaats S79, dat gefuseerd is met een enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) tag (voor subcellulaire lokalisatie) en een dubbele hemagglutine (HA) tag (voor proteïne-expressie analyse). Fosforylatie van de reporter wordt bepaald met een commercieel beschikbaar phospho-ACC-antilichaam. Deze reporter kan worden gebruikt om de in vivo SnRK1 kinase activiteit te bestuderen in geïsoleerde mesofyl-protoplasten of intacte planten. Na heterologe expressie in bacteriën en opzuivering kan deze reporter ook gebruikt worden voor in vitro kinase-assays. De functionaliteit en specificiteit werden met behulp van de snf1 mutant ook bevestigd in gistcellen (S. cerevisiae).

Trehalose-6-fosfaat (T6P), een intermediair van de trehalose-biosynthese en een belangrijke groeiregulator, inhibeert de activiteit van SnRK1 onder optimale groeiomstandigheden in jonge weefsels (Zhang et al., 2009). Een belangrijke doelstelling van dit onderzoek is dan ook het achterhalen van de onderliggende moleculaire mechanismen. Gebruikmakend van cellulaire en in vitro assays (met de ACC-reporter) werd het remmende effect van T6P op SnRK1 activiteit in jonge weefsels en de noodzaak voor een bijkomende intermediaire factor naast de regulatorische SnRK1 subeenheden bevestigd. Vervolgens gingen we na of dit regulatorisch mechanisme geconserveerd is in gist, waardoor we gebruik zouden kunnen maken van de effectieve genetische analyse in gist om de moleculaire mechanismen op te helderen. Een rol voor T6P in de regulatie van SNF1 werd gesuggereerd door de observatie dat de bijkomende mutatie van Snf1 in de tps1 mutant het groeidefect van deze cellen op snel-fermenteerbare koolstofbronnen herstelt. SNF1 T-loop fosforylatie, ACC-reporter fosforylatie en subcellulaire lokalisatie van Mig1 (een SNF1 doelwit-transcriptiefactor) in wild type en tps1 mutante cellen wezen er echter op dat gist SNF1 activiteit niet door T6P gereguleerd wordt. Verdere analyse van genexpressie, proteïne-stabiliteit en enzymactiviteit van de twee SNF1-gereguleerde enzymen fructose-1,6-bisfosfatase (gecodeerd door FBP1) en fosfoenolpyruvaat carboxykinase (PCK1) wijzen eerder op een rol voor T6P in de regulatie van de gluconeogenese, stroomafwaarts en onafhankelijk van SNF1-activiteit. Tenslotte werd ook de rol van twee SNF1-gereguleerde transcriptiefactoren, Cat8 en Sip4, onderzocht, maar geen van beide bleek betrokken in de T6P-gemedieerde regulatie.

De rol van SnRK1 signalering in groei en ontwikkeling werd verder onderzocht door genexpressie-analyse in een ontwikkelingsreeks van Arabidopsis rozetbladeren. Tijdens voorgaand onderzoek werd een opmerkelijke piek waargenomen in de expressie van DIN6 (DARK-INDUCIBLE6), een gekend SnRK1 doelwitgen, wat de betrokkenheid van SnRK1-signalering in een metabole of ontwikkelingsovergang suggereert. Deze piek valt bovendien samen met de groei van het petiool en een verminderde suiker-opstapeling. Reeds vroeg in de bladontwikkeling vindt een transitie van celdeling naar celexpansie plaats. Gebruikmakend van expressie in bladmesofylprotoplasten, vonden we een directe link tussen SnRK1 signalering en celdeling; SnRK1 onderdrukt cycline (CYCD3;1 en CYCB1;1) promoter-activiteit. De transiënte expressie van celdelingsregulatoren in volledig gedifferentieerde bladcellen blijkt bovendien een effectief hulpmiddel om de celcyclusregulatie te bestuderen. De piek in DIN6-expressie tijdens de bladontwikkeling vindt echter plaats na de overgang van celdeling naar celexpansie. Bovendien wees expressie-analyse uit dat de piek ook niet overeenkomt met de juveniel-adult transitie. De analyse van genen betrokken in metabole activiteiten suggereert dat de piek in DIN6 expressie waarschijnlijk geassocieerd is met de overgang van ontwikkelende bladeren van sink (netto import van sucrose) naar source (actieve fotosynthese en netto export van sucrose) activiteit. In cellulaire assays met over-expressie van de catalytische SnRK1 subeenheid KIN10 werden echter hoofdzakelijk genen geïnduceerd die betrokken zijn in sink-activiteiten.

Gezien de belangrijke rol van SnRK1 tijdens groei en ontwikkeling is verdere analysis van de SnRK1-functie noodzakelijk. De beschikbaarheid van specifieke en directe activatoren of inhibitoren zou dit onderzoek sterk bevorderen. Daarom hebben we het protoplast-assay geoptimaliseerd voor highthroughput screenen van kleine chemische componenten. Nieuwe doelwitpromoter-luciferase reporterconstructen werden ontwikkeld op basis van een diepzeegarnaal-nanoluciferase, voor een sterkere bioluminescentie en een vereenvoudigd protocol, en de optimale protoplastconcentratie voor gevoelige assays werd bepaald.